單克隆抗體與基因工程抗體的制備第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理第二節(jié)單克隆抗體的制備第三節(jié)基因工程抗體制備第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用總結(jié)內(nèi)容提要

第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：壽命長雜交瘤細(xì)胞：壽命長，單克隆抗體流程一、雜交瘤技術(shù)不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞

動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）免疫脾細(xì)胞細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫免疫小鼠。淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞發(fā)育。漿細(xì)胞。抗原接種培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（三）細(xì)胞融合細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞注意事項(xiàng)：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾細(xì)胞的制備：1×108的淋巴細(xì)胞無菌手術(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化。飼養(yǎng)細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3)50%PEG1min內(nèi)加完;2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液融合方法SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時(shí)間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個(gè)。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：8-雜氮鳥嘌呤聚乙二醇HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;長命脾細(xì)胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：長期生長繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(limitingdilution)

顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)

二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞有限稀釋法效率最高價(jià)格昂貴FACS配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過度生長防止細(xì)胞密度過高而死亡細(xì)胞冷凍的意義

第二節(jié)單克隆抗體的制備

經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除腹腔注射法前5天進(jìn)行,預(yù)先腹腔注射pristane（1～5）×106細(xì)胞1～3w形成腹水高滴度腹水可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細(xì)胞）二、 單克隆抗體的純化ELISAELISA多頭加樣槍。免疫熒光法鹽析沉淀親和層析離子交換層析McAb的純化Ig類型、亞類測定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價(jià)測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性優(yōu)點(diǎn)：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療（二）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高

McAb

PcAb

抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低

穩(wěn)定低高沉淀反應(yīng)無有成本高低McAb與PcAb的比較McAbandPcAb第三節(jié)基因工程抗體制備基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。

將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體一、人源化抗體方法：從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力（一）嵌合抗體嵌合抗體定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療（二）改型抗體Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段SdAb：單區(qū)抗體

二、小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合三、抗體融合蛋白許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩個(gè)抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。四、雙特異性抗體

分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。化學(xué)交聯(lián)BsAb

將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤(quadroma)。但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用時(shí)存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng)(HAMA)，因此不適用于臨床。細(xì)胞工程BsAb

多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb。基因工程BsAb定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性

五、噬菌體抗體庫技術(shù)用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性的抗體片段。抗體庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機(jī)組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人（一）基本原理和程序噬菌體抗體庫從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的Ig基因片段；構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達(dá)的噬菌體抗體庫(surfacedisplayantibodylibrary)常用載體；表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。構(gòu)建噬菌體抗體庫模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容,能包含B細(xì)胞全部克隆建庫的外源基因來自人體多克隆細(xì)胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性（二）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn)避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)抗體庫的大容量抗體庫極高的篩選效率可獲得高親和力的人源化抗體VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程所用的抗體基因又來自人體第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑蛋白質(zhì)的提純小分子抗體的應(yīng)用抗體融合蛋白的應(yīng)用雙特異抗體的應(yīng)用抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景病原微生物抗原、抗體的檢測腫瘤抗原的檢測免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測激素測定細(xì)胞因子的測定一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑病原體測定：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形蟲,風(fēng)疹病毒,巨細(xì)胞病毒，單純皰疹病毒細(xì)胞表面CD測定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型激素的測定：

內(nèi)分泌疾病的診斷藥物測定(TDM)：抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛研究工作中的探針：越來越多未知功能cDNA的克隆對復(fù)雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加免疫沉淀二、蛋白質(zhì)的提純

單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。MACS定義：

分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段優(yōu)點(diǎn)：分子量小,穿透性強(qiáng),抗原性低不含F(xiàn)c段，不會與帶有Fc段受體的細(xì)胞結(jié)合，不良反應(yīng)少可在原核系統(tǒng)表達(dá)及易于基因工程操作半衰期短，有利于及時(shí)中和及清除毒素三、小分子抗體的應(yīng)用應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療細(xì)胞內(nèi)抗體：在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性識別某一基因產(chǎn)物可干擾該基因產(chǎn)物的生物活性研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系腫瘤的體內(nèi)顯像診斷單鏈抗體排除速度快，穿透力強(qiáng)，在腫瘤組織中的分布指數(shù)較完整抗體分子高放射顯像時(shí)，放射性核素排除較快，對身體危害程度小，顯像的本底較低理想的顯像定位診斷載體病毒的診斷和抗病毒感染血液性疾病的診斷白血病的免疫診斷及分型四、抗體融合蛋白的應(yīng)用在體外免疫檢測中的應(yīng)用自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)快速檢測HBV和HIV病原體等避免化學(xué)交聯(lián)減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測的敏感度用雙特異抗體作為二抗，檢測限達(dá)1ng/ml五、雙特異抗體的應(yīng)用在體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像診斷中的應(yīng)用方法：雙特異抗體的一只臂結(jié)合靶