萆苓方對糖尿病痛風模型大鼠PGE2、COX-2水平的影響摘要目的：探討萆苓祛痛方（萆苓方）對糖尿病痛風模型大鼠PGE2、COX-2水平的影響。方法：選取健康雄性SD大鼠50只，體重180±20g。適應性喂養1周，隨機分為正常組、模型組、萆苓方組、吲哚組、吡格列酮組。正常組予以普通飼料喂養，其余組予高脂飼料喂養。4周后以鏈脲佐菌素35mg/kg腹腔注射一次誘導糖尿病模型，以血糖≥16.7mmol/l作為糖尿病成模的標準。成模后萆苓方組按10g/kg、吲哚美辛組按5mg/kg、吡格列酮組按15mg/kg給藥，正常組、模型組予等量生理鹽水。4天后關節腔注射5g/L尿酸鈉溶液1次，誘導痛風模型。20天后腹主動脈取血測定血糖、血尿酸、PGE2、COX-2的表達水平。結果：與正常組相比，模型組PGE2、COX-2明顯升高（p<0.01）；給藥后，萆苓組、吲哚組指標顯著降低（p<0.01）。造模后，各組動物體重均低于正常組（p<0.05或p<0.01）；給藥后，吡格列酮組與萆苓組體重較模型組增高（p<0.05）。與正常組相比，模型組血糖、血尿酸明顯升高（p<0.01），給藥后，萆苓組、吲哚美辛組血糖、血尿酸顯著降低（p<0.05或p<0.01）。結論：萆苓方可幫助恢復體重,降低血糖、血尿酸水平，明顯抑制PGE2、COX-2高表達。關鍵詞萆苓方糖尿病痛風大鼠體重PGE2COX-2EffectofBilingPrescriptiononPGE2andCOX-2LevelsinDiabeticGoutModelRats【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofbilingqutongprescription(referredtoasbilingprescription)onthelevelsofPGE2andCOX-2inratswithdiabeticgout.Methods50healthymaleSDratswereselected,withaweightof180+/-20g.After1weekofadaptivefeeding,theywererandomlydividedintonormalgroup,modelgroup,bilingprescriptiongroup,indomethacingroupandpioglitazonegroup.Thenormalgroupwasfedordinaryfeed,whiletherestwerefedhigh-fatfeed.Fourweekslater,streptozotocin35mg/kgwasadministeredintraperitoneallytoinducediabetesmodel,andbloodglucoseof16.7mmol/lwasusedasthestandardfordiabetesmodeling.Aftermoulding,thebilingprescriptiongroupwasgiven10g/kg,indomethacingroup5mg/kgandpioglitazonegroup15mg/kg,whilethenormalgroupandmodelgroupweregivenequalsaline.After4days,thejointcavitywasinjectedwith5g/Lsodiumuricacidsolutiononcetoinducegoutmodel.Bloodoftheabdominalaortawastaken20dayslatertodeterminetheexpressionlevelsofbloodglucose,uricacid,PGE2andCOX-2.ResultsAftermodeling,theweightofeachgroupwaslowerthanthatofthenormalgroup(p<0.05orp<0.01).Aftertheadministration,theweightofpioglitazonegroupandbilingprescriptiongroupwashigherthanthatofthemodelgroup(p<0.05),andtherewasnosignificantchangeinindomethacingroup(p>0.05).Comparedwiththenormalgroup,PGE2andCOX-2inthemodelgroupweresignificantlyincreased(p<0.01).Afteradministration,theindexesofthedruggroupweresignificantlyreduced(p<0.01).Comparedwiththenormalgroup,bloodglucoseanduricacidinthemodelgroupweresignificantlyincreased(p<0.01).Afteradministration,bloodglucoseanduricacidinthezhenlinggroupandindolegroupweresignificantlydecreased(p<0.05orp<0.01).ConclusionBilingprescriptioncanhelptorecoverbodyweight,reducebloodglucoseanduricacidlevel,andsignificantlyinhibitthehighexpressionofPGE2andCOX-2.【Keywords】bilingprescription,diabeticgoutrats,weight,PGE2,COX-2隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，我國糖尿病和痛風的患病率逐年上升，嚴重影響人們的生活質量。兩病的發生與高血脂、高血壓、肥胖、遺傳等原因息息相關，且兩病之間可互相影響，互為危險因素［1］。前列腺素(prosta-glandins,pGs)是花生四烯酸(rachidonicacid)的代謝產物,它是炎癥反應的重要介質。pGs能保護胃和十二指腸粘膜,維護腎及血小板功能,但也可誘發人和動物的急性炎癥反應,其中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)起著更為重要的作用，它能使局部毛細血管擴張，血管通透性增加，組織充血水腫，還有使痛覺過敏和致痛作用［2-6］。環氧化酶(Cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸轉化為PGE2的關鍵酶，它包括兩個亞型：環氧化酶-1(Cyclooxygenase，COX-1)，環氧化酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)。COX-1是結構型酶，具有生理性保護功能，參與合成pGs,以調節外周血管阻力、保護胃粘膜、維持腎臟血流量及調節血小板聚集；COX-2為誘導型酶，存在于單核巨噬細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、成纖維細胞和內皮細胞等處［6-7］，正常的生理狀態下幾乎不表達或低表達，一旦受到刺激如組織損傷、炎癥、癌基因、生長因子、細胞因子時表達迅速上調，參與多種病理生理過程［8］。本文旨在觀察中藥萆苓方對糖尿病痛風模型大鼠血清中PGE2、COX-2表達水平的影響，探討萆苓方治療糖尿病合并痛風的作用機制。1材料和方法1.1實驗動物取清潔級健康SD雄性大鼠50只，體重180±20g，購自于安徽醫科大學動物實驗中心，許可證號scxk（皖）2017001。大鼠飲食、活動正常，皮毛光澤，反應靈敏。1.2主要藥物與試劑萆苓方（由萆薢、土茯苓、澤瀉、黃柏、蒼術、懷牛膝、威靈仙、虎杖、薏苡仁、當歸、土鱉蟲等藥物組成，安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥物制劑中心提供）；吲哚美辛片（上海新黃河制藥有限公司，藥準字號：H31020148，產品批號：01717004）；吡格列酮（江蘇德源藥業股份有限公司，批準文號:H20110048）；尿酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，批號：S16N8I46625）；吐溫80（上海源葉生物科技有限公司，批號：M19A6K2526）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號：20160805426）；PGE2試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號：20180412）；COX-2試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號：20180412）。1.3主要儀器血糖監測儀（美國強生公司，型號：穩豪型）；酶標儀（雷杜公司型號：RT-6000）；高速臺式冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司，型號：JW3021HR）；漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司型號：GL-88B），移液器（Eppendorf公司型號：0.5-1000ul），排槍（Eppendorf公司型號：50-300ul），電熱恒溫箱（上海三發公司型號：DNP-9052BS-Ⅲ）。1.4糖尿病模型制作選取健康雄性SD大鼠45只，體重180±20g。適應性喂養1周后，按數字表法隨機選出9只作為正常組，予基礎飼料喂養，其余作為實驗組，給予高脂飼料（蛋白質15%、脂肪20%、碳水化合物50%、膽固醇5%、豬油10%）喂養。4周后造模，造模前禁食不禁水12h，臨用前將pH4.5的檸檬酸緩沖液與STZ配制成1%濃度的STZ溶液，模型組及各藥物組按35mg/kg單次腹腔注射STZ溶液，正常組按此用量折算出相當量的生理鹽水注射一次。72h后尾靜脈取血測血糖，以血糖≥16.7mmol/l作為糖尿病成模的標準［9］，造模不成功者追加1/3STZ劑量。觀察記錄各組大鼠進食、飲水量、體重、精神狀態、毛色等。1.5痛風關節模型制作糖尿病模型成功后，大鼠給藥4天，第四天除正常組外，每只實驗鼠均選右側踝關節外后方為穿刺點，針口斜面朝前上方與脛骨成45度夾角穿入踝關節腔，以4號針頭向關節腔注入0.2ml尿酸鈉溶液（取250mg尿酸鈉結晶，加入45ml0.9%氯化鈉注射液，再加5ml吐溫80，加熱攪拌，配成5g/L的尿酸鈉溶液）一次，以關節囊對側鼓起為注入標準，誘導痛風模型。正常組注射等量生理鹽水。1.6分組及給藥將成模的實驗組大鼠隨機分為模型組、萆苓方組、吲哚美辛組、吡格列酮組，萆苓方組按10g/kg、吲哚美辛組按5mg/kg、吡格列酮組按15mg/kg給藥，正常組、模型組予等量生理鹽水，每日灌胃1次，連續3周。期間剔除未成模大鼠2只，因感染死亡大鼠3只。1.7觀察指標大鼠連續給藥3周，末次給藥后禁食12小時，處死前稱體重，以10%水合氯醛按3.5ml/kg腹腔注射麻醉，立即取腹主動脈血，送至安徽中醫藥大學第一附屬醫院生化室測定血糖、血尿酸、PGE2、COX-2。1.8統計方法實驗數據采用SPSS21.0軟件進行統計學處理，計量資料的數據用表示，兩組比較采用t檢驗進行處理，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，并做相關性分析。2結果2.1對大鼠體重的影響表1結果提示：大鼠造模后，模型組、吡格組、萆苓組、吲哚組大鼠體重均低于正常組（P<0.05或P<0.01），治療后3周，吡格組、萆苓組大鼠體重明顯高于模型組（P<0.05），組間比較，萆苓組與吡格組療效相近（P>0.05），吡格組療效明顯優于吲哚組（P<0.05）。表1對大鼠體重的影響（X±S）組別例數（只）造模前（g）療后第1周（g）療后第2周（g）療后第3周（g）正常組9199.78+14.76209.89+13.36220.44+11.59229.56+10.89模型組9200.44+10.79190.33+12.43##178.11+11.33170.56+9.68吡格組9199.67+12.35196.33+12.29#192.56+13.86189.00+17.21*△萆苓組9200.67+12.47195.44+13.76#190.00+13.97184.44+15.13*吲哚組9201.11+12.34194.44+12.15#185.78+12.29174.22+11.29注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與吲哚組比較，△P<0.05。2.2對大鼠血糖、血尿酸的影響表2結果提示：與正常組相比，模型組、各藥物組大鼠血糖明顯升高（P<0.01），與模型組相比，治療后萆苓組、吡格組大鼠血糖明顯降低（P<0.05或P<0.01），組間比較，萆苓組、吡格組療效優于吲哚組（P<0.05）；與正常組相比，模型組血尿酸明顯升高（P<0.01），與模型組比較，萆苓組、吲哚組大鼠血尿酸明顯降低（P<0.01），組間比較，萆苓組、吲哚組療效相近（P>0.05），且明顯優于吡格組（P<0.01）。表2對大鼠血糖、血尿酸的影響（X±S）組別例數（只）療前血糖（mmol/l）療后血糖（mmol/l）血尿酸（umol/l）正常組95.72+0.975.76+0.8073.00+7.31模型組918.13+2.27##17.55+3.14144.25+25.35##吡格組916.45+3.72##12.71+2.18**△138.25+15.82萆苓組916.06+2.19##14.00+2.32*△92.86+17.25**△△吲哚組917.46+2.06##15.19+1.2890.88+22.04**△△注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；組間比較，△P<0.05，△△P<0.01。2.3對大鼠PGE2、COX-2的影響表3結果提示：與正常組相比,模型組COX-2、PGE2的含量明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，各藥物組COX-2、PGE2的含量明顯降低（P＜0.01），組間比較，吲哚組與萆苓組COX-2、PGE2療效相近（P＞0.05），優于吡格組（P<0.01）。表3對大鼠PGE2、COX-2的影響（X±S）組別例數（只）COX-2(ng/L)PGE2(ng/L)正常組959.86±4.6281.34±2.48模型組9145.72±12.35##324.16±20.10##萆苓組986.82±3.55**△145.69±10.33**△吡格組9107.18±10.93**199.86±16.12**吲哚組982.86±3.39**△142.09±14.69**△注：與正常組比較##P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01；與吡格組比較，△P<0.052.4相關分析相關分析顯示，高血糖與高血尿酸具有相關關系，相關系數r=0.346，（p<0.05）；高血糖與COX-2有顯著相關性，相關系數r=0.634，（p<0.01）；高血糖與PGE2有顯著相關性，相關系數r=0.652，（p<0.01）；高尿酸與COX-2的具有相關性，相關系數r=0.732，（p<0.01）；高尿酸與PGE2相關性，r=0.750，（p<0.01）；COX-2與PGE2具有顯著相關性，r=0.945，（p<0.01）。3討論有研究表明，糖尿病和痛風有共同的發病基礎，血尿酸增高可加重糖尿病患者的代謝紊亂［10］，痛風合并糖尿病患者的血尿酸水平也比單純痛風患者更高［11］。因此，能夠同時改善高血糖與高血尿酸水平的藥物，對于提高療效，改善患者依從性，具有重要意義。本實驗正是探討了中藥萆苓方對于血糖、血尿酸及PGE2、COX-2的影響。前列腺素E2（PGE2）是一種重要的炎癥介質，當細胞膜上磷磷脂酶A2(phoshPolipaseA2)受到致炎因子等某種因素的刺激時,釋放花生四烯酸，在環氧化酶的作用下產生，其大量生成可引起并加重一系列炎癥反應，促使局部毛細血管擴張，血管通透性增加，組織充血水腫，加重疼痛［2-6］，還可導致胰島β細胞的功能障礙［12］，影響胰島素的分泌。本次實驗顯示，模型組PGE2的含量明顯升高（P＜0.01），藥物治療后，萆苓組PGE2的含量明顯降低（P＜0.01）。表明萆苓方可通過降低PGE2的水平，減輕炎癥反應，緩解糖尿病痛風的臨床癥狀，降低血糖、血尿酸水平。環氧化酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)是環氧化酶的一個亞型，在正常狀態下幾乎不表達，一旦受到刺激如外傷、炎癥后迅速合成，增加血管通透性，產生炎性因子，誘導巨噬細胞趨化，激活基質金屬蛋白酶，活化白細胞和血小板，且能降低人體對胰島素的敏感性。另一方面，COX-2作為PGE2的限速酶，與PGE2有交互作用，它催化花生四烯酸轉化為PGE2，誘導炎性反應，抑制胰島β細胞的功能。本次實驗表明，模型組COX-2的表達明顯升高（P＜0.01），給藥后，萆苓組COX-2的含量明顯降低（P＜0.01）。說明萆苓方可通過抑制COX-2的高表達，緩解炎癥反應，改善胰島功能，達到降糖降尿酸的作用。此可能是萆苓方降糖降尿酸的機制之一。實驗中我們采用鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型，成模后各實驗組大鼠較正常組大鼠出現明顯多飲、多食、多尿癥狀，且體重明顯低于正常組（P<0.05或P<0.01）。藥物治療后3周，吡格組、萆苓組大鼠“三多”癥狀改善，體重明顯高于模型組（P<0.05）。說明萆苓方可明顯改善糖尿病的臨床癥狀。對血糖的影響與我們以往的報道一致，萆苓方有良好降糖降尿酸作用。可一箭雙雕，多靶點發揮降糖降尿酸抗炎作用。相關分析顯示，高血糖與高血尿酸具有相關關系，表明二者之間相互影響，互為危險因素。與COX-2、PGE2有顯著相關性，證實高血糖、高血尿酸均與炎癥因子有關，COX-2及PGE2參與其中，互為因果，加重了對機體的損害。糖尿病屬中醫“消渴”范疇，痛風屬中醫“痹病”、“白虎歷節”范疇，其發病多與感受外邪、飲食不節、遺傳等因素有關，其病機為本虛標實，本虛乃脾腎虧虛，臟腑功能衰弱，標實為濕瘀毒互結，阻滯氣血經絡。萆苓方正是以清熱利濕，瀉濁解毒，活血止痛立法。方中土茯苓、澤瀉、萆薢、薏苡仁利濕瀉濁；威靈仙祛風濕，通經絡；黃柏、蒼術清熱燥濕解毒；當歸、虎杖、土鱉蟲活血止痛；懷牛膝補肝腎，強筋骨，利關節。現代醫學研究發現，萆薢主要成分為萆薢皂苷A有降低血尿酸的作用，和牛膝總皂苷合用可明顯降低PGE2的水平，通過抑制炎性細胞因子的合成達到較強的抗炎作用［13］。土茯苓能夠抑制細胞免疫反應，影響T淋巴細胞釋放淋巴因子以后的炎癥過程，還具有利尿和鎮痛作用［14］。虎杖含有虎杖苷、藜蘆醇、大黃素等成分，可降低血清中PGE2的水平，抑制促炎因子轉錄以及蛋白質的合成作用［15］。薏苡仁、茯苓、澤瀉有利尿、降血糖、調節免疫之功能［16-17］。威靈仙總皂苷可通過抑制T淋巴細胞過度增殖、抑制細胞因子和PGE2發揮抗關節炎作用［18］。黃柏、當歸、蒼術可通過對氧自由基以及炎癥部位的PGE2的清除達到抗炎鎮痛作用［19］。土鱉蟲有一定程度的血管內皮細胞保護作用，對糖尿病周圍神經病變有干預作用［20］。綜上所述，本方通過降低COX-2、PGE2的高表達，消除炎癥反應，保護胰島功能，發揮良好的調節血糖、血尿酸、改善糖尿病痛風癥狀的作用。參考文獻［1］于健.糖尿病合并痛風患者胰島素抵抗的臨床研究[J].華西醫大學報，2002，33(3）:486-487.［2］丁皓.前列腺素與炎癥[J].中國病理生理雜志，1987,3（1）：47-51.［3］任公平，那輝，佟雷，等.辣椒素通過下調COX-2和mpges-1抑制IL-1β誘導的NCI-H460細胞PGE2含量的實驗研究[J].西安交通大學學報(醫學版),2016,37(2):283-306.［4］劉瑩露,吳薇,徐天舒.膽寧片對膽色素結石型豚鼠膽汁CRP、血清PGE2及血清胰島素敏感性的影響[J].西部中醫藥,2017,30(11):18-21.［5］寇毅英，李永芳，楊梅，等.十五味乳鵬散對尿酸鈉致大鼠急性痛風性膝關節炎COX-2，PGE2水平的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(1):117-120.［6］張娟,汪志軍,胡亞楠，等.環氧化酶——藥物開發的新靶點[J].藥學進展,2002,26(5):