關于植物基因工程_抗蟲抗病基因

第一章抗植物病蟲害基因

及其應用第一節抗植物蟲害基因及其應用第二節抗植物病毒基因及其應用第三節抗植物真菌病害基因及其應用第四節抗植物細菌病害基因及其應用

第2頁,共139頁，2024年2月25日，星期天第一節概述一、作用及意義二、抗性基因的來源三、抗性基因分類

第3頁,共139頁，2024年2月25日，星期天一、作用及意義

應用抗病蟲害基因具有以下優勢：

1.

育種周期短、效率高、成本低。

2.

提高產量和品質。

3.降低生產成本。

4.

防止化學農藥污染，避免破壞生態平衡。

5.

克服親本基因資源缺乏。

6.抗性性狀具有連續性和整體性。第4頁,共139頁，2024年2月25日，星期天二、抗性基因的來源

根據基因來源分為三類：

1.植物組織如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。2.動物如殺菌肽（cecropins）基因。3.微生物如Bt殺蟲結晶蛋白基因。

第5頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

三、抗性基因分類據基因的作用功能和對象分為：

1.抗蟲基因。

2.抗病毒基因。

3.抗真菌和細菌基因。

第6頁,共139頁，2024年2月25日，星期天第二節抗植物蟲害基因及其應用

一、Bt基因及其應用二、蛋白酶抑制劑基因及其應用三、植物凝集素基因及其應用四、淀粉酶抑制劑基因及其應用

第7頁,共139頁，2024年2月25日，星期天一、Bt基因及其應用

Bt基因的作用原理2.ICP的分類、結構及抗蟲譜Bt基因的應用4.存在的問題及對策

第8頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1.Bt基因的作用原理Bt基因：是從微生物蘇云金桿菌（Bacillusthu-ringicnsis）分離出的蘇云金桿菌殺蟲結晶蛋白基因，簡稱Bt基因。蘇云金桿菌屬于革蘭氏陰性，形成孢子細菌。在芽胞形成過程中，可產生伴胞晶體，它由一種或多種蛋白組成，具有高度特異性殺蟲活性，這種蛋白通常被稱作δ-內毒素（δ-endotoxins）或殺蟲結晶蛋白（in-secticidalcrysta1protein，ICP）。

第9頁,共139頁，2024年2月25日，星期天作用原理：

ICP通常以原毒素（protoxin）形式存在，當昆蟲取食ICP后，原毒素在昆蟲的消化道內被活化，轉型為毒性多肽分子。活化的ICP與昆蟲腸道上皮細胞上的特異性結合蛋白結合，全部或部分嵌合于細胞膜中，使細胞膜產生一些孔道，細胞因滲透平衡糟破壞而破裂。導致昆蟲幼蟲停止進食，最終死亡。

第10頁,共139頁，2024年2月25日，星期天ICP的活化過程：首先ICP溶解在昆蟲的腸道里（ICP在堿性條件可溶，而在中性條件下不溶），然后，在蛋白酶的作用下，通過專一性蛋白酶水解切割，ICP被活化。活化的ICP不被胰蛋白酶或其它蛋白酶破壞。第11頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2．ICP的分類、結構及抗蟲譜

據抗蟲譜和序列同源性分為四種類型：類型I（CryI）抗鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲，對其幼蟲有特異的毒性作用。類型II（CryII）抗鱗翅目和雙翅目（Diptera）。類型III（CryIII）

抗鞘翅目（Coleoptera）昆蟲。類型IVw（CryIV）抗雙翅目（Diptera）昆蟲。第12頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

類型V（CryV）抗鱗翅目和鞘翅目。

近年Payne等人則發現了具有抗膜翅目（Hymeno-ptera）以及抗線蟲（Nematodes）的ICP。第13頁,共139頁，2024年2月25日，星期天在每種主要類型中，據序列同源性，ICP又劃分為若干亞類例如，CryI又分為IA(a)、IA(b)、IA(c)、IB、IC等。第14頁,共139頁，2024年2月25日，星期天ICP的結構CryＩ蛋白為長1100～1200個氨基酸的多肽，大小為130～140kD，其毒性多肽分子是約60～70kD的核心片段。活性區在氨基端，而原毒素羧基端至少一半以上的氨基酸序列沒有毒性功能。第15頁,共139頁，2024年2月25日，星期天只保留編碼毒性核心片段的核苷酸序列就能達到抗蟲目的。如，Bt2編碼的最短毒性片段位于29至607氨基酸殘基處，進一步從基因3′端刪除4個密碼子（codon）或從5′端刪除8個密碼子，將完全喪失產物的毒性功能。第16頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3.Bt基因的應用

1987年比利時的Vacek等人利用農桿菌介導法首次獲得了轉基因煙草植株。他們使用全長的CryIA（b）基因編碼1155個氨基酸和該基因保留了5ˊ端編碼毒蛋白核心區域的缺失片段（編碼610個氨基酸）。轉基因植株對煙草天蛾（ManducaSexta）幼蟲的抗性為75％～100％。

第17頁,共139頁，2024年2月25日，星期天美國Monsanto公司的Fischhoff等人（1987年）獲得轉Bt基因的番茄植株。他們用帶有CaMV35S啟動子的CryIA(b)基因轉化番茄品系VF36。獲得了對煙草天蛾顯示出高抗蟲活性的轉基因植株。但因ICP表達水平低，對番茄果螟（Heliothisvirescens）的抗性不強。第18頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

目前全世界已有許多不同類型的ICP基因轉入多種作物，如煙草、番茄、玉米、棉花、水稻、蘋果、核桃等。第19頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

研究結果表明：一般用全長CryIA基因轉化植物，ICP在轉基因植物中表達量很低，甚至檢測不到，其抗蟲效果差或不具抗蟲性。在高抗蟲性的轉基因植株中，每毫克可溶性蛋白中約有2.6～190ng的ICP。第20頁,共139頁，2024年2月25日，星期天4.

存在的問題及對策（1）ICP在植物中表達水平低（2）昆蟲對ICP產生抗性（3）抗菌譜窄第21頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（1）ICP在植物中表達水平低

原因：

主要是mRNA不穩定和翻譯效率低。天然的Bt基因富含A、T堿基,而植物基因富含G、C堿基,可能導致Bt基因轉錄的末成熟終止（prematuretranscriptiontermination）及不適當的切割。因密碼子上的差異也可能使Bt基因在植物細胞的轉錄過程中形成二級結構、mRNA的特定序列被降解和翻譯效率降低。第22頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

為提高富含A、T堿基的Bt基因在富含G、Ｃ堿基的植物細胞中表達水平。有人對CryI基因進行了部分甚至完全的修飾。修飾后的CryI基因在轉基因棉花、煙草、番茄和玉米中的表達水平有了顯著提高。對策1：修飾Bt基因，改造密碼子。第23頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

Monsanto公司的Per1ak等人在不改變氨基酸序列的情況下，對CryIA(b)和CryIA(c)基因進行修飾（主要是去除富含A、T堿基序列），使CryIA(b)和CryI(c)的表達水平提高了100倍，CryIA(b)和CryI(c)蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的0.05％～0.1％，獲得良好的抗蟲效果，其中轉基因棉花植株對棉鈴蟲（Heliothisarmingera）的抗性達80％。第24頁,共139頁，2024年2月25日，星期天對策2：使用新啟動子（包括組織

特異性啟動子）Koziel等人合成了一個富含G,C堿基的CryIA(b)基因，該合成基因編碼CryIA(b)的部分氨基酸，與野生型CryIA(b)基因只有65％的同源性。并用適合在玉米中表達的密碼子替代原細菌密碼子。

第25頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

利用基因槍把該基因導入玉米品種。使用3種啟動子：1.CaMV35S啟動子。2.玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)啟動子。3.玉米花粉特異性啟動子調控。后兩種啟動子調控下的CryIA(b)基因在轉基因玉米植株中顯示出明顯的組織特異性。即在綠色組織中，CryIA(b)基因強烈表達，占可溶性蛋白0．1％～0.4％。第26頁,共139頁，2024年2月25日，星期天對策3：尋找新一代啟動子

除組織特異性啟動子外，研究人員也尋找第二代啟動子來提高ICP基因的表達水平。例如,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動子和葉綠體轉運肽，可以使轉基因煙草中的CryIA(ｃ)表達量提高10-20倍。第27頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（2）昆蟲對ICP產生抗性

對策1：使用組織專一性或化學誘導啟動子。

使用組織專一啟動子，可使Bt基因的表達局限在植物重要的組織。第28頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

例如，只在棉花的棉鈴中表達，末經選擇的害蟲能在葉片上存活。病原相關蛋白（pathogen-sis-relatedprotein,即PR蛋白）是植物受到病原物侵染或其它刺激時表達的一組蛋白。PR-la是編碼其中一種PR蛋白的基因,可因侵染而被誘導,也可被一些化學刺激物(包括水楊酸和聚丙酰酸)誘導。第29頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

目前，CIBA的研究小組已經獲得帶PR-la啟動子調控Bt基因的轉基因煙草。

用化學藥劑處理該基因煙草，它對煙草天蛾產生抗性。因此采用上述化學誘導啟動子的方法可以調控Bt基因在化學誘導劑存在下才能表達,從而降低抗性的選擇壓產生,以防止抗性擴散。

第30頁,共139頁，2024年2月25日，星期天對策2：修飾Bt基因,使ICP在植物中

高劑量表達。

迄今，目前發現的高水平的Bt抗性基因都是隱性基因,而且ICP對害蟲的幼蟲特別有效,所以Bt基因的連續、高劑量表達，可以消除突變雜合體。第31頁,共139頁，2024年2月25日，星期天對策3：使用兩種以上的Bt基因或Bt

與其它抗蟲基因結合使用。

除非抗性位點出現的頻率很高和毒蛋白劑量低到雜合體可以存活，否則昆蟲幾乎不可能對兩種獨立殺蟲蛋白同時產生耐受性。

第32頁,共139頁，2024年2月25日，星期天對策4：將轉與非轉基因的植株混種

在繁育群體中保留一部分末經選擇的害蟲，防止害蟲對Bt基因的抗性擴散。

第33頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（3）抗菌譜窄

對策：采用多基因導入策略，利用基因之間的協同擬菌作用，向植物體內同時導入多個基因。第34頁,共139頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白酶抑制劑（PI）基因

及其應用

1.PI基因的抗蟲原理2.PI的分類及抗蟲譜3.PI基因的應用

第35頁,共139頁，2024年2月25日，星期天是一類蛋白質，在植物防御昆蟲和病原體侵染的天然防御系統中起著重要作用，具有明顯的抗蟲作用的蛋白質。PI基因的抗蟲譜廣泛，可抗幾個目的昆蟲。

蛋白酶抑制劑（proteinasein-

hibitor,PI）：第36頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

PI存在于自然界的所有生命體中，在大多數植物的種子和塊莖中的含量可高達總蛋白的1％-10％。在有些果實中絲氨蛋白酶抑制劑的含量可達總蛋白的30％。

第37頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1.PI基因的抗蟲原理（1）PI與昆蟲消化道內的蛋白消化酶相結合，形成酶抑制劑復合物（EＩ），從而阻斷或減弱蛋白酶對于外源蛋白質的水解作用，導致蛋白質不能被正常消化。第38頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（2）EI復合物能刺激昆蟲過量分泌消化酶，使昆蟲產生厭食反應。停止進食而缺乏代謝所需的一些氨基酸，導致昆蟲發育不正常或死亡。第39頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（3）蛋白酶抑制劑分子可能通過消化道進入昆蟲的血淋巴系統，從而嚴重干擾昆蟲的蛻皮過程和兔疫功能，以致昆蟲不能正常發育。第40頁,共139頁，2024年2月25日，星期天PI的作用特點：（1）PI作用于蛋白消化酶的活性中心。活性中心是酶最保守的部位，產生突變的可能性極小，故可以排除害蟲通過突變產生抗性的可能性。第41頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（2）PI對于人、畜無害，因人、畜與昆蟲的消化機理明顯不同。人、畜的蛋白消化酶主要存在于腸道中，而PI在胃中的酸性條件下，被胃蛋白酶分解。第42頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2.PI的分類及抗蟲譜

植物中存在三類：（1）絲氨酸蛋白酶抑制劑（2）巰基蛋白酶抑制劑（3）金屬蛋白酶抑制劑

第43頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（1）絲氨酸類蛋白酶抑制劑大多數昆蟲所利用的蛋白消化酶是絲氨酸類蛋白消化酶，特別是類胰蛋白酶，因此抗蟲效果明顯，

絲氨酸類蛋白酶抑制劑有6種，最有效的有，豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）和馬鈴薯蛋白酶抑制劑（patatoinhibitor，PI）

第44頁,共139頁，2024年2月25日，星期天豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）：

抗蟲譜廣泛，抗蟲效果最理想。抗鱗翅目、鞘翅目、直翅目。第45頁,共139頁，2024年2月25日，星期天CpTI是由80個氨基酸組成的小分子多肽，分子中富含二硫鍵，它的一個分子具有兩個抑制活性中心。CpTI與胰蛋白酶緊密結合，使酶活性中心失活。第46頁,共139頁，2024年2月25日，星期天馬鈴薯蛋白酶抑制劑

（patatoinhibitor，PI）：有2類：PI-I家族和PI-II家族

第47頁,共139頁，2024年2月25日，星期天PI-I家族：

包括馬鈴薯和番茄蛋白酶抑制劑I，其成熟肽單體分子量為8.1kD，只有一個活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶

第48頁,共139頁，2024年2月25日，星期天PI-II家族：

包括馬鈴薯和番茄蛋白酶抑制劑II，其成熟肽單體分子量為12.3kD，有兩個活性中心，可分別抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋肉酶。

PI-II比PI-I抗蟲效果好。對煙草天蛾等一齡幼蟲抗性明顯。第49頁,共139頁，2024年2月25日，星期天（2）巰基蛋白酶抑制劑對利用巰基蛋白酶消化植物蛋白的昆蟲具有特殊抗性。水稻巰基蛋白酶抑制劑（oryzacystatin）是抗蟲能力較強的一種PI。其基因序列內有兩個內含子，cDNA編碼102個氨基酸的小肽，分子量約為１1．5kD，分子中部第52位后的Ｇln-Val-Val-Ala-Gly具有高度保守性,該保守區對于維持抑制劑活力是必要的。第50頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3.蛋白酶抑制劑基因的應用

1987年，英國Durham大學的Hilder等把編碼CpTI的cDNA轉移到煙草品種Sam-sunNN中，首先獲得轉CpTI基因的工程植株。第51頁,共139頁，2024年2月25日，星期天該cDNA長550bP，由CaMV35S啟動子調控。獲得的煙草轉基因植株能夠正確表達CpTI基因，有的轉基因植株中CpTI的表達量高達9.6μg／mg可溶性蛋白。而CpTI的表達量達到5μg／mg可溶性蛋白時，轉基因植株就表現出明顯的抗蟲性。第52頁,共139頁，2024年2月25日，星期天目前已把CpTI基因轉移到許多有重要經濟價值的植物中，如，水稻、油菜、白薯、蘋果和楊樹等。

第53頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

目前已經有許多種蛋白酶抑制劑的基因或cDNA被克隆，其中有些表現出明顯的抗蟲作用。CpTI基因、PI-II基因和水稻巰基蛋白酶抑制劑基因是植物抗蟲基因工程中應用最廣、研究較深入的蛋白酶抑制劑基因。

第54頁,共139頁，2024年2月25日，星期天提高PI基因表達水平的對策：

深入研究基因表達的調控機理。使用特定啟動子修飾蛋白酶抑制劑基因。

第55頁,共139頁，2024年2月25日，星期天中科院遺傳研究所利用不同的啟動子和Ω因子對CpIT基因進行修飾，得到不同的植物表達質粒。其中Ω因子來自煙草花葉病毒（TMV）126kD蛋白基因轉錄序列5ˊ未端的非轉譯區，由68bp組成，能夠促進mRNA翻譯。利用CaMV35S啟動子串聯Ω因子調控的CpTI基因轉化煙草，轉基因煙草中CpTI的表達顯著提高，但高效表達易引起轉基因煙草的白化。第56頁,共139頁，2024年2月25日，星期天三、植物凝集素基因及其應用1.基本特性2.主要種類3.抗蟲原理4.基因的應用

第57頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1.基本特性

植物凝集素（lectin）是非兔疫來源的糖蛋白或結合糖的蛋白質(sugar-bindingprotein)，它們能聚集細胞和（或）沉淀糖蛋白。主要存在于細胞的蛋白粒中。第58頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

最主要的特性是能和糖類結合。多數是一些寡聚蛋白,二聚體或四聚體，少數含有兩個糖結合部位的單體，如蓖麻毒蛋白。植物凝集素的蛋白質結構和基因結構有許多相似性。第59頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

許多植物凝集素的一級結構、凝集素與配體結合物的三維立體結構或基因結構被測定。凝集素廣泛存在于植物界，在各種組織器官中均有發現，尤以豆科植物的種子中含量最為豐富。第60頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2.主要種類

（1）麥胚凝集素（wheatgermagg1utinin，ＷGA）（2）雪花蓮（Galanthusnivalis，GNA）凝集素（3）豌豆外源凝集素（pea-lectin,p-Lec）

第61頁,共139頁，2024年2月25日，星期天麥胚凝集素：是禾本科中典型的植物凝集素，有三種WGAＩ、WGAII和WGAIII，氨基酸組成相近。分子中甘氨酸和半胱氨酸含量很高，極性氨基酸的含量很低，不含糖。

第62頁,共139頁，2024年2月25日，星期天雪花蓮：一級結構、生物合成以及基因結構已經清楚，由105個氨基酸殘基組成的成熟蛋白，包括3個重復性同源片段，每個約25個氨基酸殘基。對于蚜蟲、葉蟬、稻褐飛虱等同翅目吸食性害蟲具有極強的毒性，也能控制蚜蟲一類的吸汁性害蟲。

第63頁,共139頁，2024年2月25日，星期天豌豆外源凝集素：由275個氨基酸的組成的蛋白質。有活性的豌豆外源凝集素由以α和β兩個亞基組成。能抑制豇豆象的生長。

第64頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3.抗蟲原理當被昆蟲取食后，外源凝集素在昆蟲的消化道中與腸道圍食膜上的糖蛋白專一性結合（即不同的外源凝集素與相應的糖類結合），從而影響營養的吸收。可能在昆蟲的消化道內誘發病灶，促進消化道中細菌的繁殖。

第65頁,共139頁，2024年2月25日，星期天4.植物凝集素基因的應用

上述凝集素等的編碼基因已經分離，并被成功地導入煙草和萵苣等植物中。用CaMV35S啟動子或水稻蔗糖合成酶基因啟動子調控，轉基因煙草對蚜蟲表現出明顯抗性。第66頁,共139頁，2024年2月25日，星期天Bou1ter等（1991）豌豆凝集素基因的轉基因煙草植株再與轉CpTI基因植株雜交，獲得了既能表達豌豆凝集素又能表達CpTI的雙價轉基因煙草，其抗蟲能力顯著提高。這也表明了基因間的協同作用有可大大提高作物的抗性。

第67頁,共139頁，2024年2月25日，星期天Maddock等（1990）用基因槍轉化玉米胚性懸浮系，獲得的表達麥胚凝集素基因的轉化植株對歐洲玉米螟具有良好的抗性。存在的問題：轉基因植株是否對人、畜無害，還有待證實。

第68頁,共139頁，2024年2月25日，星期天四、淀粉酶抑制劑基因及其應用

1.基本特性2.抗蟲原理3.應用第69頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1.基本特性

淀粉酶抑制劑（α-amylaseinhibitor，α-AI）是植物界普遍存在的一類蛋白質，它能抑制哺乳動物及昆蟲體內的α-淀粉酶的活性，阻斷對攝取食物中淀粉成分的消化。α-AI對植物本身和細菌的小α-淀粉酶不起作用。

α-AI作用的最適pH值為5.6，因此對鞘翅目昆蟲（消化道呈酸性的）有良好抗性。

第70頁,共139頁，2024年2月25日，星期天α-AI的三種類型（小麥和大麥）：

單體，12kD。對黃粉蟲、米象的抑制效果明顯優于二聚體。二聚體，24kD。對馬鈴薯甲蟲、鋸谷盜的抑制效果優于單體。四聚體，60kD。

第71頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2.抗蟲原理

抑制昆蟲消道內α-淀粉酶的活性。α-AI和淀粉酶結合成的EI復合物刺激昆蟲過量分泌消化酶，通過神經系統反饋，產生厭食反應，最后導致非正常發育或死亡。第72頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3.淀粉酶抑制劑基因的應用Altabella等（1990）把菜豆αAI基因導入煙草，并能準確、穩定地表達。分析表明：它對黃粉蟲的腸道α-淀粉酶具有顯著的抑制效果，同時也抑制豬胰α-淀粉酶的活性。對哺乳動物的淀粉酶抑制作用大大限制了其在生食作物基因工程中的應用。第73頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

植物抗病基因工程第74頁,共139頁，2024年2月25日，星期天第一節

抗植物病毒基因及其應用第75頁,共139頁，2024年2月25日，星期天致病來源不同：病毒（virus）：生物病毒是一類個體微小，結構簡單，只含單一核酸（DNA/RNA），必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型微生物。真菌（Fungus，fungi(復））：一類單細胞或多細胞微生物。不含葉綠素，大都能形成硬的多糖細胞壁。屬于真核生物，包括真菌門和黏菌門等。細菌（bacteria）：為原核生物是指一大類細胞核無核膜包裹，只存在稱作擬核區或擬核的裸露DNA的原始單細胞生物。第76頁,共139頁，2024年2月25日，星期天病毒病引起的作物病害是十分嚴重的，僅以馬鈴薯為例，Χ病毒(PVX)引起的產量損失可10%,Y病毒（PVY）引起的損失可達80％，然而迄今雜交常規育種對病毒病的防治尚無良策。基因工程技術為培育抗病毒病的新品種開辟了途徑。植物抗病毒基因工程的技術路線已趨向成熟。第77頁,共139頁，2024年2月25日，星期天第78頁,共139頁，2024年2月25日，星期天基因工程抗病毒的技術路線：（1）導入病毒外殼蛋白基因。（2）利用病毒的衛星RNA（satelliteRNA,Sat-RNA）。（3）利用病毒非結構蛋白基因（特別是復制酶-replicase基因）。（4）缺損干擾顆粒（人工構建）（defectiveinterferingparticle）（5）干擾素（interferon）基因（6）利用反義RNA技術（7）利用中和抗體法技術（8）設計核酶剪切病毒RNA第79頁,共139頁，2024年2月25日，星期天第一節抗植物病毒基因及其應用

一、外源病毒外殼蛋白（coatprotein，CＰ）基因二、病毒復制酶基因三、衛星RNA四、核糖體失活蛋白基因五、干擾素基因六、缺陷干擾穎粒第80頁,共139頁，2024年2月25日，星期天一、外源病毒外殼蛋白（CＰ）基因CP基因的抗病毒原理2.轉基因植株的特點3．CP基因的應用4.存在的問題

第81頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1.CP基因的抗病毒原理當入侵病毒的裸露核酸進入植物細胞后，立即被細胞中的自由CP包裹，阻止了入侵病毒核酸的翻譯和復制。在ＣＰ水平上抑制病毒脫殼。第82頁,共139頁，2024年2月25日，星期天導入的CP基因都是缺失的不完整的，該類基因主要是缺少AUG密碼子，當這種不能被翻譯的CP基因或CP基因的反義RNA基因整合到植物染色體上后，能使轉基因植株獲得很好的抗性說明這類轉基因植株的抗性機理不是外殼蛋白在起作用，而可能是它們的RNA轉錄體與入侵病毒RNA之間相互作用。。第83頁,共139頁，2024年2月25日，星期天許多種類病毒組及病毒的ＣＰ基因具有同源結構，在一定的條件下，一種ＣＰ基因將可能抗多種病毒。第84頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2.轉基因植株的特點抗性與ＣＰ表達量成正相關。在一定程度上延緩或減輕發病，不影響生長發育、孕性表現和生理表現。抗性可穩定地遺傳給子代。抗性水平與整合到植物細胞中的CP基因拷貝數有關，多拷貝的比單拷貝的抗性高。第85頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3．CP基因的應用

目前已被克隆的CP基因：

TMV、馬鈴薯Ｘ病毒（potatovirusX，PVX）、黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus,CMV)、PVY、水稻條紋葉枯病毒（ricestripevirusvirus,RSV）、TSWV、PLRV、TRV、苜蓿花葉病毒（alfafamosaicvirus,ALMV）、洋李痘病毒（plumpoxvirus,PRV）等。第86頁,共139頁，2024年2月25日，星期天Monsanto公司在1988年獲得了表達TMV的CP基因的番茄品種VF36的轉基因植株。在接種后表現出延遲發病，發病率小于5%，產量幾乎不受影響，而對照植株則100%發病，果實減產26-35%。第87頁,共139頁，2024年2月25日，星期天Monsanto公司1990年把PVX和PVY的CP基因同時導入北美最重要的馬鈴薯品種ＲussetBurbank，其中篩選出的一個轉基因株系在接種條件下，完全抗PVX和PVY，而田間試驗表明,傳毒蚜蟲接種16周后,轉基因植株只有8%的發病率,而對照植株的發病率卻高達79.3%。第88頁,共139頁，2024年2月25日，星期天荷蘭Wageningen農業大學把TSWV的CP基因導入煙草SR1,試驗室接種實驗表明,轉化植株獲得了90%的保護效果,而對照株在接種后6天全部發病。第89頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1991年日本國家農業環境所獲得了水稻品種KinuhikariNipponbai的轉RSV的CP基因的抗紋葉枯病病毒的工程植株，接蟲實驗表明，轉基因植株在2-3周后,只有3%-5%的發病率,而對照植株的發病率為95%-100%。這是禾本科作物中用基因工程獲得抗病毒特性的第一例成功報道。第90頁,共139頁，2024年2月25日，星期天奧地利的農林大學的科研人員把歐洲和整個地中海地區的核果實樹的最重要的病毒PVR的ＣＰ基因導入杏。第91頁,共139頁，2024年2月25日，星期天在國內，中科院微生物所等單位獲得了煙草NC89的雙抗株系（抗MTV＋CMV）和單抗株系（抗TMV）。純合系的大田試驗表明，轉基因植株的抗病毒效果達70％。已獲得轉CP基因植株：煙草、馬鈴薯、水稻、番茄、歐洲李和杏等。第92頁,共139頁，2024年2月25日，星期天4.存在的問題

轉基因植株對病毒的抗性水平不高，且僅限于特定的病毒或密切相關的病毒。轉基因植株大多只是推遲發病，而不能徹底根治。異源包被：轉基因表達的一種病毒外鞘蛋白可能包被另一種相近的有害病毒基因，形成一種新的雜合體。第93頁,共139頁，2024年2月25日，星期天二、病毒復制酶基因抗病毒原理應用特點

第94頁,共139頁，2024年2月25日，星期天病毒復制酶基因：是病毒非結構蛋白基因。復制酶一般是在病毒核酸進入寄主細胞并結合到寄主核糖體之后形成。第95頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1.抗病毒機理RNA轉錄體干擾病毒的復制。病毒非結構蛋白基因介導抗性。復制酶基因抑制病毒復制必須具備2個條件：1.具有一定空間構象。

2.不完整性。第96頁,共139頁，2024年2月25日，星期天攜有編碼54kD蛋白基因的轉基因煙草中檢測不到54kD的蛋白產物，這說明很可能是其RNA轉錄體干擾了病毒的復制TMV的編碼126kD的完整基因導入植株后，植株卻未獲得抗性；而若插入1.4kD的核酸序列，使其基因失去功能，則能賦予植物抗性。。第97頁,共139頁，2024年2月25日，星期天把ＴＭＶ的ＲＮA編碼126kD蛋白的通讀部分(readthrough)的54kD（包含病毒復制酶核心功能團）的基因導入煙草，轉基因煙草對TMV表現出很高的抗性(接毒500μg/ml,植株不發病)。很可能是不完整的復制酶亞基基因賦予了植物細胞這種抗性。第98頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2.病毒復制酶基因特點

病毒復制酶基因所介導的抗性強。遠遠強于ＣＰ基因介導的抗性。即使對轉基因植株使用高濃度的病毒或其RNA，仍具有明顯抗性。第99頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3.病毒復制酶基因的應用用豌豆早褐病毒（PEBV）221kD的復制酶中相當于TMV的54kD部分的核酸片段轉化煙草，獲得的轉基因植株對高達1000μg/ml的接種量仍具有高度抗性。第100頁,共139頁，2024年2月25日，星期天將編碼CMV復制酶的二個亞基的缺失的cDNA轉入煙草，工程植株可抗500μg/ml的病毒或100μg/mlRNA的接種量。第101頁,共139頁，2024年2月25日，星期天三、衛星RNA抗病毒原理應用存在問題

第102頁,共139頁，2024年2月25日，星期天衛星RNA：衛星RNA是多核苷酸，它們有時在其相伴病毒中被發現。它們按照相伴病毒的復制和傳播機制，從一個植株傳到別一個植株。它們不與其相伴病毒的核苷酸序列同源，對病毒的復制也不起作用。但是衛星RNA具有改變其相伴病毒的致病力的能力。

第103頁,共139頁，2024年2月25日，星期天1.抗病毒原理相應病毒侵入植物細胞，其衛星RNA被激活和放大，對病毒產生抗性。抗性水平不因病毒的接種量而降低。植物細胞中只要有低濃度的衛星RNA的轉錄體即可產生抗性。第104頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2.病毒衛星RNA的應用

目前獲得一些帶有病毒衛星RNA的轉基因植株。如，表達CMV和煙草環斑病毒（TRV）的衛星序列的轉基因煙草植株。當被其相應的病毒侵染時，其發病癥狀減輕。第105頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3.存在問題

只有少數植物病毒含有衛星RNA，限制了應用范圍。衛星RNA有可能被其自然的病毒載體包裝并釋放到環境中。一個核甘酸的突變可能會造成嚴重病狀，或病毒衛星RNA和植物衛星RNA重組，從而產生一種難以預料的病癥。有些衛星RNA能夠增強病毒的致病力。第106頁,共139頁，2024年2月25日，星期天四、核糖體失活蛋白基因1.RIP分類2.RIP作用機理3.RIP基因的應用第107頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

是一類能抑制蛋白質生物合成的蛋白，廣泛存在于高等植物中，含量豐富。核糖體失活蛋白：

（ribosome-inactivatingprotein，RIP）第108頁,共139頁，2024年2月25日，星期天１.RIP分類

據結構可為2種類型：I型RIP：是單鏈堿性蛋白質。分子量約為30kD，帶有或不帶有糖基，但其生物活性都一樣，都具有抑制無細胞蛋白質生物合成的作用,對完整細胞或動物呈無毒或低毒。II型RIP：是由A、B兩條肽鏈通過二硫鍵組成的二聚體。分子量約為60kD。其A鏈與I型RIP同源呈酸性或堿性，是毒性分子，B鏈是凝集素，能結合到細胞膜表面并協助A鏈進入細胞。第109頁,共139頁，2024年2月25日，星期天２.RIP作用機理RIP選擇性作用于60S核糖體大亞基，抑制肽鏈延伸。大多數植物和細菌中的RIP是通過它的N一糖苷酶（N-g1ycosidase）活性來抑制蛋白質合成的功能。它特異地作用于28ＳrRNA的第4324位核苷酸的腺瞟呤與核糖之間的N一糖苷鍵，進行水解，除掉腺瞟呤，使核糖體失活，不能合成蛋白質。第110頁,共139頁，2024年2月25日，星期天真菌中的RIP則通過其核酸酶（RNase）活性起作用，RIP專一水解真核細胞核糖體28ＳrRNA第4325和4326位核苷酸之間的磷酸二酯鍵。不同的RIP分別對于病毒、真菌和昆蟲具有不同的抗性。能使植物獲得廣譜抗性。第111頁,共139頁，2024年2月25日，星期天商陸抗病毒蛋白

(pokeweedantiviralprotein，PAP)抗植物和動物的多種不同病毒。現已分別從商陸的春葉、夏葉和種子中分離出三種PAP，分子量分別為29kD、30Kd、31kD。均不含糖的單鏈RIP。PAP抑制病毒，使病毒不能制造自身的蛋白，同時也不能利用寄主細胞的蛋白。第112頁,共139頁，2024年2月25日，星期天３.RIP基因的應用Monsanto公司克隆了編碼PAP的基因。通過農桿菌介導，把該基固導入煙草和馬鈴薯細胞，并獲得了轉基因植株。含高濃度的PAP（＞１0ng／mg蛋白）的轉基因煙草植株生長發育緩慢，患葉斑病，而且敗育。含較低濃度的PAP（1～5ng／mg蛋白）的植株生長正常。第113頁,共139頁，2024年2月25日，星期天五、干擾素基因抗病毒原理干擾素基因的應用

第114頁,共139頁，2024年2月25日，星期天抗病毒原理干擾素是一類分子量小的蛋白質，能結合在細胞質膜上，并導致抗病毒態的形成。干擾素促進寡核苷酸合成酶、核酸內切酶和激酶的產生，導致抗病毒態。三種酶平時處于靜止狀態，當細胞被病毒感染后才活化，活化后通過兩種不同途徑來阻斷蛋白質的合成。一是活化后的激酶將蛋白質合成過程中所需的起始因子磷酸化，使其喪失活性。二是由寡聚腺苷酸激活一種核酸內切酶，降解mRNA。干擾素作用特別強，且賦予細胞對病毒的廣譜抗性。第115頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2.干擾素基因的應用

愛沙尼亞科學院、芬蘭農業研究中心及赫爾辛基大學的研究人員共同合作，把大鼠中編碼干擾素之一的2ˊ，5ˊ－寡腺苷酸合成酶的基因導入馬鈴薯，獲得轉基因植株，用PVX進行浸染，葉和塊莖里的病毒濃度顯著低于未轉化的對照。效果好于ＣＰ基因的效果。第116頁,共139頁，2024年2月25日，星期天六、缺陷干擾顆粒及其利用缺陷干擾顆粒（defectiveinterfering，DI）：是指序列與親本病毒相關、但必須依賴于病毒才能復制的RNA分子。第117頁,共139頁，2024年2月25日，星期天在自然界中，這種分子存在于多種動物病毒和植物病毒中。與衛星RNA的區別：DI顆粒和病毒核酸同源，DI顆粒直接來源于病毒的核酸序列。與反義RNA的區別：DI顆粒是利用有義RNA去競爭病毒復制酶的結合位點，從而干擾病毒復制。

第118頁,共139頁，2024年2月25日，星期天Marsh等發現用大麥花葉病毒（barelymosaicvirus，BMV）的RNA2構建的DＩ顆粒在大麥原生質體內對病毒的復制有干擾。而Stan1ey等人則從非洲木薯花葉病毒（ACMV）中克隆了缺陷干擾顆粒DNAB。經串聯重復后導入煙草，獲得的轉基因植株抗ACMV的感染。

第119頁,共139頁，2024年2月25日，星期天

第二節抗植物真菌病害基因及其應用第120頁,共139頁，2024年2月25日，星期天植物真菌病害基因分類：1、增強細胞壁結構包含:富含羥脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸蛋白（增加細胞壁結構）過氧化物酶催化苯基類丙烷醇脫氫聚合，生成木質素木質素合成：苯丙氨酸裂解酶（PAL）、苯基苯乙烯酮合成酶（CHS).2、誘導產生或激活抗菌物質硫堇、植物抗毒素、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶3、其他：抗性（PR）蛋白、植物凝集素、PGIP、羥脯氨酸糖蛋白（與植物防衛反應有關）第121頁,共139頁，2024年2月25日，星期天一、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶基因及應用1、幾丁質酶作用機理幾丁質酶存在于植物和微生物，有降解幾丁質的作用，幾丁質是大多病原真菌的細胞壁的主要成分，降解細胞壁幾丁質，不僅破壞細胞新物質的沉積，使病原體死亡，而且細胞壁碎片具有誘導作用，誘導產生抗病反應。2、β-1,3-葡聚糖酶作用機理同上機理第122頁,共139頁，2024年2月25日，星期天2、特點（1）需病菌誘導煙草：軟腐細菌侵染48H內幾丁質酶可增加12倍；TMV感染可增加20倍。（2）協同性隨β-1,3-葡聚糖酶和PR等其他蛋白形成，發揮防衛作用。第123頁,共139頁，2024年2月25日，星期天3、應用1）利用策略直接應用：灌水、種衣劑引入工程菌，表達分泌轉基因植物2）實例1991轉基因植株立枯病13-15天后，死苗率22.7%-37.1%，對照53%日本煙草抗白粉病荷蘭幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶基因番茄3-4周出現枯萎病對照和一種外源基因轉基因植株死亡。第124頁,共139頁，2024年2月25日，星期天二、植物抗毒素基因及應用1、作用機理植物產生的對一些不同種類的病原真菌等具有毒性的物質，亦稱植保素。植物收侵染后產生的一類低分子抗菌化合物，受合成基因的調控。合成基因工程培育抗病品種。不同科屬植物中鑒定了200多種植保素，其中黃酮與類萜類植保素研究最多。2、特點：植保素生產速度快、積累含量與植物的抗病性有密切相關性。3基因類型：