關于蛋白質的提取純化和分析材料選擇和預處理細胞破碎蛋白質的粗提目錄題目分析蛋白質的純化分析檢測第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天1題目解析已知某蛋白的分子量約為17kDa，等電點3.9~4.1，它能耐一定的高溫，在90°C加熱3~4min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結合后可以暴露它的疏水基團。該蛋白的作用是作為生物體內酶的激活劑。在鈣離子的作用下才能起到暴露疏水集團發揮性能，結合蛋白質基礎知識從而可以判斷其為鈣調蛋白。第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天材料的選擇TEXT材料的預處理成年健康雄性大鼠腦組織20克（比雌鼠體積大，成本較低物種易獲得）將切取的組織用4℃預冷0.01mol/l的PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS（磷酸鹽緩沖液）第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

預處理過的組織

細胞破碎（高速珠磨法）

制備組織細胞懸液（剪碎法）

蛋白質被釋放出來331122破碎第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天剪碎法1.將組織塊放入平皿后，加入少量PBS；2.用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入10mlPBS；3.用吸管吸取組織勻漿，用200目尼龍網過濾到試管內；返回第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天高速珠磨法破碎機理：高速珠磨法是一種有效的細胞破碎方法，珠磨機是該法所用的設備，其結構示意圖見圖（1）。微生物細胞懸浮液與極細的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細胞之間的互相剪切、碰撞促進細胞膜破裂，釋出內含物。在珠液分離器的協助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出，從而實現連續操作。破碎中產生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天鈣調蛋白的粗提取抽提蛋白質破碎后，使用適當的溶劑，將蛋白質提取溶解到溶劑當中，常用稀酸、稀堿、有機溶劑等電點3.9~4.1酸性蛋白質稀堿性溶液抽提溶液堿性的程度，堿性過大則難以復性pH調至等電點偏堿的一側（4.1）第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天粗提取物離心操作除去固體雜質的上清液第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天熱變性初步純化天然結構%鈣調蛋白一般蛋白100℃熱穩定性不同第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天其他方法鹽析法等電點法有機溶劑法第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3蛋白質的精純和分析鑒定第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天親和色譜配體蛋白質蛋白質和配體復合物交聯試劑載體配體載體與配體交聯體雜質雜質游離配體洗脫結合耦聯作用機理第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天金屬螯合親和層析鈣調蛋白的外形似啞鈴,有兩個球形的末端,中間被一個長而富有彈性的螺旋結構相連,每個末端有兩個Ca2+結構域,每個結構域可以結合一Ca2+,這樣,一個鈣調蛋白可以結合4個Ca2+,鈣調蛋白與Ca2+結合后的構型相當穩定。第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天金屬螯合色譜原理：利用固定相載體上偶聯的亞胺基乙二酸為配基

與二價金屬離子發生螯合作用，結合在固定相

上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱

氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發生特異螯合

作用而進行分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天步驟1.制作金屬螯合親和色譜柱：用濃度為0.2mol/L的CaCl2溶液上柱。將上清液PH調制6-8，加入蛋白質解離抑制劑。慢上樣3.再用配體CaCl2溶液洗脫，下方流出為目的蛋白液，用大使管或者燒杯盛裝之。2.上柱后依次用50mlbufferB、200ml含0.5mol/LNaCl的bufferB洗脫。下方用大試管或燒杯收集雜質液。第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天配體蛋白質蛋白質和配體復合物第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天步驟目的：除去蛋白液中配體離子方法一：半透膜進行透析方法二：將上次獲得目的蛋白液經凝膠過濾色譜柱下方首次接受的溶液即為高純度的鈣調蛋白溶液；第二次接受到的即為配體離子的溶液。第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天凝膠過濾色譜的洗脫第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天定性分析分析鑒定定量分析第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天定性分析第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測定

蛋白質分子量

用SDS-PAGE檢測不同純化階段所獲得的提取液樣品中CaM的純度與相對分子質量。電泳采用質量分數為15%的分離膠和質量分數為5%的濃縮膠，120V電壓條件下進行電泳，直至溴酚藍達到凝膠底部，考馬斯亮藍染色，凝膠成像儀成像。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天定量分析紫外檢測法簡單快速不破壞樣品準確度低考馬斯亮藍染色法簡單迅速干擾少靈敏度高(1μg)Folin-酚試劑法靈敏度高常用第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天goalsFolin-酚試劑法在堿性條件下