ICS07.100

B46

備案號：62090-2019DB21

遼寧省地方標準

DB21/T3062—2018

微生物飼料添加劑質量控制技術規范

Technicalspecificationonqualitycontrolofmicrobialfeedadditives

DB21/T3062—2018

微生物飼料添加劑質量控制技術規范

1范圍

本標準規定了微生物飼料添加劑及混合型微生物飼料添加劑生產、采樣、檢驗、鑒定、包裝、保存、

運輸過程中的質量控制和技術要求，描述了菌種檢驗、鑒定及產品性能驗證的通用方法。

本標準適用于微生物飼料添加劑及混合型微生物飼料添加劑，不適用于轉基因微生物飼料添加劑。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB10648飼料標簽

GB13078飼料衛生標準

GB/T23181微生物飼料添加劑通用要求

NY/T1444微生物飼料添加劑技術通則

JJF1070定量包裝商品凈含量計量檢驗規則

《中華人民共和國獸藥典》

《中華人民共和國農業部公告第2045號飼料添加劑品種目錄》

《伯杰氏細菌系統鑒定手冊》

《伯杰氏細菌命名手冊》

3術語和定義

3.1微生物飼料添加劑Microbialfeedadditives

微生物飼料添加劑是指在飼料中添加或直接飼喂給動物的微生物或微生物及其培養物，參與調節胃

腸道內微生態平衡或者刺激特異性或非特異性免疫功能、具有促進動物生長和提高飼料轉化效率的微生

物制劑。

3.2混合型微生物飼料添加劑Mixedmicrobialfeedadditives

由一種或一種以上的微生物飼料添加劑與載體或稀釋劑按一定比例混合，但不屬于添加劑預混合飼

料的飼料添加劑產品。

3.3目的菌Targetmicroorganisms

系指直接用于生產的菌種。

3.4種子批Seedlot

系指特定菌株的貯存物，通常包括原始種子、主種子批和工作種子批，建立種子批系統旨在保證原

粉生產的一致性。

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3.5原始種子Primaryseed

系指細菌分離株經適應性培養、傳代后，經生物學特性、免疫原性和遺傳穩定性等特性研究鑒定，

可用于微生物飼料添加劑生產的種子。原始種子用于主種子批的制備。

3.6主種子Mainseed

系由原始種子傳代擴增至特定代次，并經一次制備獲得的同質和均一的懸液或干粉分裝于容器制備

而成。主種子用于制備工作種子。

3.7工作種子Workingseed

系由主種子傳代擴增至特定代次，并經一次制備獲得的同質和均一的懸液分裝于容器制備而成。

4生產要求

微生物活菌的制備方法、工藝應能保證其成品含有足夠的活菌數量，并在有效期內保持其穩定性，

同時應防止外源因子的污染。

4.1生產用菌種

4.1.1名稱及來源

生產用菌種應來自動物體內和人體的正常菌群;或對動物體及人體無毒無害、具有促進正常菌群生

長和活性作用的外籍細菌。細菌的分離過程和傳代背景應清晰，應具備穩定的生物學和遺傳學特性，并

能保持穩定的活菌狀態，經實驗室和臨床試驗證明安全、有效。并獲得具有資質的微生物鑒定機構出具

的菌種鑒定報告。

4.1.2種子批的建立

種子批分為三級，分別為原始種子、主種子和工作種子。

4.1.3種子批的檢定

菌種的屬、種型分類鑒定，應依據最新版伯杰氏細菌系統鑒定手冊（Bergey＇sManualofSystematic

Bacteriology）和伯杰氏細菌命名手冊（Bergey＇sManualofDeterminativeBacteriology）的有關規定進

行，包括形態、生長代謝特性檢查。

4.1.3.1培養特性

將菌種接種于特異性培養基，置有氧或厭氧環境中培養，觀察其生長情況，確定菌種的好氧條件；

以劃線法觀察在瓊脂平皿上生長的單個菌落的形狀、大小、表面、邊緣、透明度、色澤等特征；也可觀

察菌種在不同溫度、pH值或不同濃度的氯化鈉溶液等條件下的生長特性等。

4.1.3.2染色鏡檢

取菌種的新鮮培養物涂片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的染色反應、形態、大小和排列等，

有芽孢的細菌應同時觀察芽孢的形狀、大小和位置（也可增做芽孢染色）。檢查結果均應符合原始菌種

的特性。

4.1.3.3生化反應

按特異的方法進行，應包括目的菌的關鍵生化反應，結果應符合原始菌種的特性。

4.1.3.4遺傳特性分析

采用16SrRNA序列測定，應符合原始菌種的遺傳特性。

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4.1.3.5種子批的保存

原始種子和主種子應凍干保存于4℃或-20℃，工作種子應置于2℃～8℃保存。

種子批傳代應限定傳代次數，原始種子批和主種子批啟開后傳代次數不得超過10代，工作種子批

啟開后至發酵培養傳代次數不得超過5代。

4.1.3.6安全性評價實驗

4.1.3.6.1毒性試驗

可選用靶標動物進行試驗或采用常規方法進行。

常規方法:用體重18～22g小鼠5只，每只腹腔注射0.3mL新鮮菌液，連續觀察3天，小鼠均應健

康存活；或每只小鼠經口灌胃0.5mL新鮮菌液，每天1次，連續3天，從第1天至第7天連續觀察，

小鼠均應健康存活。注：新鮮菌液濃度為不少于推薦常規菌種使用時濃度。

4.1.3.6.2抗生素敏感性試驗

采用瓊脂擴散紙片法或微量稀釋法進行菌株的抗生素敏感性檢查，應符合原始菌種的特性。

4.1.3.6.3穩定性試驗.

菌種在特異性培養基中，連續傳代30代次后，將第30代培養物做種子批檢查、鑒定，全部結果應

與原始菌種的特性一致。

4.1.3.6.4選擇性特性試驗

應根據原始菌種的特性進行耐熱性、耐酸性、耐堿性、耐膽鹽等相關特性考察。

4.1.4菌種保藏與管理

4.1.4.1管理制度

建立菌種管理制度，對菌種實行全流程管理。對菌種的保管應有專人負責，單獨保藏，實行雙人雙

鎖管理。應有程序和措施以保證菌種的安全，防止污染、丟失或損壞。

4.1.4.2菌種檔案

應建立菌種檔案，涵蓋來源、鑒定、特性、保存、傳代、使用等信息，確保溯源性和穩定性。菌種

信息應完整、準確、清晰的標識于菌種保藏管。

4.2菌粉制備

應包括種子液制備、大罐培養、收獲菌體（或芽孢）和菌體干燥制成菌粉等。

4.2.1生產用種子

使用主種子批菌種，接種于特異性培養基進行多級種子擴增，應涂片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀

察5～10個視野，細菌的染色反應、形態應一致并符合原始菌種的特征。制備過程應防止污染，菌種傳

代次數應符合規定。

4.2.2生產車間或實驗間

生產車間或實驗間符合相應實驗室無菌級別要求。生產設備和管路應經過嚴格滅菌，滅菌后檢測合

格方可使用，避免交叉污染。

4.2.3培養基

采用經批準的培養基用于生產，培養基應經過高壓蒸汽滅菌。

4.2.4培養

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DB21/T3062—2018

采用液體培養。將種子液置于特異性條件下培養（包括厭氧或需氧、溫度、時間等），培養過程中

取樣涂片做革蘭氏染色鏡檢、pH值檢測等，芽孢菌需要進行芽孢形成率的檢測，均應符合該菌種的規

定。培養結束后，取樣做純菌檢查，如發現污染應予廢棄。

4.2.5收獲菌體

液體菌培養結束后直接分裝收獲。

菌粉培養結束后采用分離技術收獲濕菌體，與分散劑、穩定劑混合后制成干粉。

4.3微生物飼料添加劑

同一工作種子批菌種生產的最多2批單一菌粉，可按批準的比例與輔料混合均勻后制成微生物飼料

添加劑，配制過程應防止污染。微生物飼料添加劑濃度為每千克全價料中不低于106cfu。

4.4混合型微生物飼料添加劑

混合型微生物飼料添加劑包括固態型、液態型和半固態型。

4.4.1菌體組成要求

生產混合型微生物飼料添加劑時，應每種菌分別培養制備單一菌粉?；旌闲臀⑸镲暳咸砑觿x

擇附錄A.1中所列菌種，且菌種數目不宜超過5種。使用一種以上菌時，不同菌之間應通過協同關系試驗。

4.4.2分批

同一批號，原料應來源一致、質量均一，按規定要求抽樣檢驗后，能對整批產品作出評定。

5采樣要求

5.1采樣原則

采集的樣品要具有代表性，能反映被采樣本的總體水平，且避免引入外來污染。

5.2采樣人員

采樣應由受過相應培訓的人員進行，采樣人員應具備對微生物生物危害及防止交叉污染的常識，采

樣時應采取佩戴口罩、手套等措施保證自身安全及避免外來污染。

5.3采樣工具

采樣工具和取樣容器要達到無菌的要求。

5.4采樣數量

采樣數量可結合檢驗需要量，應考慮到樣品分布的均一性。

5.5采樣過程

采樣應與樣品存在環境一致，對于有完整包裝的樣品，盡可能整件抽取，減少操作過程，避免污染。

對于無完整包裝或需要打開包裝抽取的樣品，要求無菌取樣。應對樣品信息進行及時、準確的記錄和標

記。

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6檢定要求

6.1微生物飼料添加劑檢定

6.1.1感官要求

應包括顏色、氣味和有無霉變。

6.1.2目的菌檢查

取菌粉加人滅菌生理鹽水或其他專屬稀釋液稀釋至1×103cfu/mL，接種在特異性瓊脂平皿上，每個

菌種的培養特性、染色鏡檢和生化反應檢查，應符合該菌種特征。

6.1.3活菌數測定

測定每克或每毫升菌粉中含有的活菌數量?；罹鷶禍y定方法按照《飼料中嗜酸乳桿菌的微生物檢

驗》、《飼料添加劑飼用活性干酵母（釀酒酵母）》、《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》等

方法執行，詳見附錄A.2。

6.1.4雜菌檢查

方法和結果判斷按NY/T1444執行，如不符合規定應廢棄。

6.1.5衛生指標測定

常規指標方法按表1執行。

表1微生物添加劑衛生指標要求

項目指標試驗方法

黃曲霉素B1，μg/kg≤10.0GB/T17480

砷（以總砷計）的允許量，mg/kg≤2.0GB/T13079

鉛（以Pb計）的允許量，mg/kg≤5.0GB/T13080

汞（以Hg計）的允許量，mg/kg≤0.1GB/T13081

鎘（以Cd計）的允許量，mg/kg≤0.5GB/T13082

大腸菌群的允許量，個/kg≤1.0×105GB4789.3

霉菌總數的允許量，個/kg≤2.0×107GB/T13092

沙門氏菌的允許量不得檢出GB/T13091

致病菌（腸道致病菌及致病性球菌）不得檢出GB4789.3、GB4789.5和GB4789.10

6.2混合型微生物飼料添加劑檢定

6.2.1感官要求

應包括顏色、氣味和有無霉變。

6.2.2目的菌檢查

檢査成品中所含的目的菌是否符合生產用菌種的特性。即按上述“4.1.3”方法進行生長特性、染色鏡

檢和生化反應檢查，應符合規定。對于混合型飼料添加劑，則須逐一檢查單一菌特性。

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DB21/T3062—2018

6.2.3活菌數測定

測定每克或每毫升產品中的活菌數，混合型飼料添加劑應分別測定各單一活菌數。測定方法按上述

“6.1.3”執行。

6.2.4雜菌檢查

方法和結果判斷按NY/T1444執行。

6.2.5衛生指標測定

常規指標方法按6.1.5執行。

6.2.6凈含量

按JJF1070執行。

7標簽、規格和包裝

7.1標簽

標簽按GB10648執行，同時標識活菌數的下限、雜菌數的上限。

7.2包裝

應符合GB/T23181的有關規定，包裝材料應無毒無菌，內包裝物采用符合衛生標準的材料，對產品

無抑制性。

8運輸和貯存

8.1運輸

產品在運輸過程中應避免暴曬、雨淋和受熱，不得與有毒有害物品混裝混運。

8.2貯存

產品應貯存于陰涼、通風、干燥處，防止暴曬、雨淋和受熱，如有特殊要求應注明。

9保質期

自生產之日起，按批準的有效期執行。

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AA

附錄A

（規范性附錄）

飼料添加劑微生物品種目錄

表A.1飼料添加劑微生物品種目錄

類別通用名稱適用范圍

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳

酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德式乳桿菌乳酸亞種（原名：乳酸

乳桿菌）、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產朊假絲酵母、釀酒

酵母、沼澤紅假單胞菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春養殖動物

雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、羅伊氏乳桿菌、動物雙歧桿菌、黑曲霉、米曲霉、

遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、纖維二糖乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿

菌保加利亞亞種（原名：保加利亞乳桿菌）

微生物

產丙酸丙酸桿菌、布氏乳桿菌青貯飼料、牛飼料

副干酪乳桿菌青貯飼料

肉雞、生長育肥豬、水

凝結芽孢桿菌

產養殖動物、犬和貓

側孢短芽孢桿菌(原名：側孢芽孢桿菌)肉雞、肉鴨、豬、蝦

丁酸梭菌

斷奶仔豬、肉仔雞

表A.2生產及質量控制中參考標準

標準序號標準名稱

GB/T20191飼料中嗜酸乳桿菌的微生物檢驗

GB/T22547飼料添加劑飼用活性干酵母（釀酒酵母）

GB/T26428飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測

NY/T1461飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌

檢測方法

NY/T1969飼料添加劑產朊假絲酵母

NY/T2131飼料添加劑枯草芽孢桿菌

SN/T3542光合細菌菌劑中沼澤紅假單胞菌計數方法

SN/T4624.2入境環保用微生物菌劑檢測方法第2部分：短小芽孢桿菌

GB4789.34食品安全國家標準食品微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗

GB8381.2飼料中志賀氏菌的檢測方法

GB/T13091飼料中沙門氏菌的檢測方法

衛生指標

GB/T13092飼料中霉菌總數測定方法

GB/T13093飼料中細菌總數的測定

GB4789.3食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數

其他GB19489實驗室生物安全通用要求

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