不同移植時間窗對骨髓間充質干細胞移植的影響

近年來，隨著神經生物學和干燥科學的發展，骨髓間質干燥物（msec）的移植和脊柱損傷（slac）的治療取得了很大進展。許多研究結果表明,MSCs移植治療SCI能明顯改善損傷脊髓的神經功能,治療作用與MSCs具有替代壞死神經元、分泌神經營養因子橋接作用和誘導等有關。然而如何把握MSCs移植的合適時間,目前的研究資料尚無肯定的答案。另外,不同移植時間窗對MSCs的生存、遷移及神經功能恢復影響的研究少見報道。為探討MSCs移植的最佳時間,本研究觀察了不同移植時間窗對經靜脈移植的MSCs在大鼠損傷脊髓內存活和遷移及其對移植后神經功能恢復的影響。1材料和方法1.1idase活性變化選用清潔級健康雄性SD大鼠90只,2～3月齡,體質量150～250g,由福建醫科大學實驗動物中心提供。其中10只用于細胞培養取材;40只用于觀察脊髓組織學和髓過氧化物酶(myoleperoxidase,MPO)活性變化,分8組:假手術組、SCI后0、6、12、24h,3、5和7d組,每組5只;40只用于觀察不同時間窗經靜脈移植的MSCs在損傷脊髓內的生存數和遷移距離,分8組:假手術組、SCI后0、6、12、24h,3、5和7d移植組,每組5只。主要試劑:αMEM培養基、胎牛血清(美國HyClone公司);胰蛋白酶(Trypsin1:250,Amersco);Ficoll-Paque分離液(美國Pharmacia公司);MPO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);核熒光染料Hoechst33342(美國PharMingen公司)。1.2良浚法良浚法按照文獻報告,暴露胸10段脊髓,采用改良Allen法,致傷量為50g×cm,造成胸10段脊髓的沖擊傷。假手術組大鼠同法暴露胸10段脊髓,不造成脊髓沖擊傷。1.3cd45、cd29、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd49、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29按常規方法體外分離、培養MSCs,并傳代,流式細胞儀檢測第2代MSCs的CD34、CD45、CD29、CD90表達。收集第3代培養7～8d的MSCs懸液,用核熒光標記液Hoechst33342(10mg/L,αMEM/F12培養液配制)孵育2h,經細胞計數后制備濃度為1×106/ml的MSCs懸液,4℃下儲存備用。1.4mscs細胞懸液的制備假手術組在手術后12h,移植組在動物模型建立后0、6、12、24h,3、5和7d,經尾靜脈注射Hoechst33342標記的第3代MSCs單細胞懸液1ml。術畢放回籠中繼續飼養。1.5損傷區頭端髓組織的測定假手術組大鼠在手術后24h,損傷組于SCI后0、6、12、24h,3、5和7d7個不同時間點再次麻醉后迅速開胸,以4%多聚甲醛500ml經左心耳灌注固定,完整地切取損傷脊髓胸10～12節段。取損傷區頭端脊髓組織約50mg,立即存放-70℃,待行MPO活性測定。取損傷區尾端脊髓組織浸入10%中性甲醛固定24h,常規乙醇脫水,石蠟包埋,以片厚5μm連續切片,H-E染色,在顯微鏡下觀察損傷區脊髓病理組織學改變情況。1.6大鼠骨髓組織勻漿的制備取存放-70℃的大鼠損傷脊髓組織和假手術組相同部位大鼠脊髓組織,電子天平稱重,按重量體積比為1∶19加勻漿介質制備成5%的組織勻漿。取組織勻漿進行MPO活性測定,具體操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。1.7運動功能觀察和運動能力分析各組大鼠分別于移植前和移植后7d放在75cm×125cm的開放空間,采用BBB后肢運動功能評分標準,3人、雙盲法獨立觀察大鼠雙后肢的運動功能并記錄。1.8骨髓縱向的熒光顯微觀察移植組大鼠在MSCs細胞移植后7d再次麻醉后迅速開胸,以4%多聚甲醛500ml經左心室灌注固定,完整地切取損傷脊髓胸10～12節段。用4%多聚甲醛后固定4h,再置于30%蔗糖溶液中浸泡至組織下沉到瓶底。用恒冷箱冷凍切片機做脊髓胸10～12節段連續縱切片,厚20μm。每組脊髓縱切片每隔5片取1片在熒光顯微鏡下(10×20)用410nm激發波長進行移植的存活細胞計數。用方格測試系統在每張縱切片的脊髓損傷區頭端和尾端組織各取4個單位面積(0.16mm2),計數這些單位面積內所發出藍色核熒光的細胞總數。計數時,以發出藍色熒光、呈橢圓形或圓形、大小較均一的細胞核作為存活MSCs的細胞核。1.9移植細胞遷移距離每組脊髓縱切片每隔5片取1片在熒光顯微鏡下(10×20)用410nm激發波長進行移植細胞遷移距離的測量。應用熒光顯微鏡本身載物臺標本移動距離測量尺測量移植細胞從脊髓損傷區邊緣遷移到頭端或尾端組織最遠處之間的距離。1.10均數標準差記錄采用SPSS10.0統計軟件分析,各項檢測結果以均數±標準差(x?±s)(x-±s)記錄。兩組間采用t檢驗,多組間采用單因素方差分析,檢驗水準取α=0.05,當P<0.05時差異有統計學意義。2結果2.1mscs的體外擴增培養的MSCs24h后逐漸出現貼壁,其他血細胞通過換液逐漸除去,此時貼壁細胞呈巨單核細胞,細胞形態不一,可有梭形、多角形或星芒狀突起,為單個或多個細胞的克隆,細胞增殖迅速。12～14d,90%以上細胞融合,融合細胞都呈梭形,原代可獲得1×106～2×106個MSCs。傳代的細胞于24h內完全貼壁,形態多呈梭形,10～12d融合,體外擴增5代細胞數約為1×1011個。流式細胞儀檢測10份第2代細胞樣本,結果顯示:CD34、CD45表達陰性,CD29、CD90表達陽性(圖1)。2.2髓組織病理學結果假手術組神經元形態正常,整個組織結構完整清晰,未見腫脹改變,核圓,可見核仁。SCI后0h,脊髓組織結構未見明顯異常;SCI后6和12h,脊髓實質內見少量點片狀出血,同時部分神經細胞出現腫脹,核偏移,核仁尚清;SCI后24h,脊髓白質內可見大片出血病灶,脊髓組織實質內有大量中性粒細胞浸潤,神經元和膠質細胞明顯水腫,部分神經元固縮、變小,核萎縮,結構不清(圖2A);SCI后3d,脊髓組織結構疏松,神經元大量壞死;SCI后5和7d,脊髓實質內神經元稀少,實質內膠質細胞增生形成瘢痕(圖3)。2.3兩組mpo活性表達比較大鼠SCI后不同時間脊髓組織MPO活性和假手術組大鼠脊髓MPO活性表達:假手術組和SCI后0h組MPO活性表達弱,分別為(4.39±0.48)nkat/g和(5.16±0.51)nkat/g;SCI后6h出現MPO活性表達增強(27.46±3.17)nkat/g,24h到達高峰(58.18±5.49)nkat/g,3d后開始下降(40.56±4.59)nkat/g,7d后回到假手術組水平(4.64±0.41)nkat/g(圖4)。與假手術組比較,SCI后6h、12h、24h、3d和5d各組的MPO活性表達差異具有統計學意義(P<0.01),SCI后0h和7d2組的MPO活性表達差異無統計學意義(P>0.05);與SCI后24h組比較,其他各組的MPO活性表達差異有統計學意義(P<0.01)(圖4)。2.4移植前各組大鼠的bcb評分差異每組大鼠移植前和移植后雙后肢運動功能的BBB評分分數差異具有統計學意義(P<0.01),移植后大鼠BBB評分分數明顯高于移植前,說明移植MSCs能明顯改善大鼠雙后肢運動功能(圖5);移植后各組之間大鼠BBB評分分數差異具有統計學意義,SCI后3d移植組BBB評分分數明顯高于其他6組(P<0.01),SCI后0、6、12和24h移植4組差異無統計學意義(P>0.05),SCI后5和7d移植2組差異無統計學意義(P>0.05)。因此SCI后3d移植MSCs,大鼠雙后肢運動功能恢復最好。2.5d移植組與鄰近組織治療髓傷超氧時期血壓ld在熒光顯微鏡下,可觀察到各組的脊髓損傷處及其鄰近組織有許多被Hoechst33342標記的移植細胞,移植的MSCs多數集中分布于脊髓損傷處,有部分遷移到鄰近組織。每組大鼠脊髓損傷處頭、尾端存活數差異無統計學意義(P>0.05);SCI后3d移植組大鼠脊髓損傷處頭端、脊髓損傷處尾端存活數和存活總數明顯高于其他6組(P<0.01)(圖6～8);SCI后0、6、12、24h,5和7d移植組間差異無統計學意義(P>0.05)。因此SCI后3d移植MSCs,大鼠脊髓內移植的MSCs存活數最多(表1)。2.6髓內移植mscs的預測結果每組大鼠脊髓內移植的MSCs向頭端和尾端組織遷移距離無統計學意義(P>0.05);SCI后0、6、12、24h和3d移植5組與SCI后5和7d移植2組相比有統計學意義(P<0.01),前5組脊髓內移植的MSCs向頭端組織或尾端組織遷移距離明顯大于后2組,SCI后0、6、12、24h和3d移植5組差異無統計學意義(P>0.05),SCI后5和7d移植2組差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。這提示SCI后5和7d移植的MSCs在損傷脊髓內遷移的能力明顯下降。3討論3.1髓組織mpo活性檢測免疫炎癥反應是SCI后的一種病理生理過程,在繼發性脊髓損傷過程中發揮重要作用。中性粒細胞是急性炎癥反應的主要炎癥細胞,MPO是一種特異性酶,與中性粒細胞的絕對數量相關聯,是一個定量中性粒細胞對損傷組織浸潤的特異和敏感標記。因此通過MPO活性測定可用來定量分析脊髓組織炎癥反應情況。本實驗結果顯示,在SCI后3d內,脊髓組織MPO活性明顯增強,組織結構損傷嚴重,表明免疫炎癥反應在脊髓繼發性損傷中發揮重要作用。本實驗結果同時顯示,在大鼠SCI后3d,脊髓組織MPO活性表達減弱,說明SCI后3d,脊髓免疫炎癥反應開始減輕。在大鼠SCI后5d和7d,脊髓組織MPO活性表達恢復到假手術組水平,但損傷區有膠質細胞增生,說明SCI后5d,由于免疫炎癥反應,誘發了脊髓組織形成瘢痕。3.2mscs在不同組織區的遷移距離本實驗觀察到,各組大鼠SCI后經尾靜脈注射MSCs,在脊髓損傷區及其鄰近組織可檢測到存活的MSCs,表明MSCs經靜脈移植能透過血腦屏障,到達損傷區及其鄰近組織。本實驗結果顯示,在SCI后0、6、12和24h不同時間窗經靜脈移植的MSCs存活數量明顯較少,說明SCI后的嚴重免疫炎癥反應對移植的MSCs產生毒性作用,不利于MSCs的存活。但另一方面,在免疫炎癥反應過程中,多種炎癥因子、炎癥細胞和細胞因子對移植的MSCs具有趨化作用,導致MSCs向損傷區及其鄰近組織遷移,本實驗觀察到,在SCI后0、6、12、24h和3d不同時間窗移植的MSCs在脊髓組織內遷移的距離明顯較長。本實驗結果進一步顯示,在SCI后5d和7d2個時間窗經靜脈移植的MSCs存活數量較少,在脊髓組織內遷移的距離較短,推測這種現象與下列因素有關,SCI后5和7d,破壞的血腦屏障結構開始重建,透過血腦屏障的MSCs數量減少;SCI后5和7d,免疫炎癥反應減弱,炎癥細胞減少,多種炎癥因子表達下調,對移植MSCs的趨化作用減弱;損傷區膠質細胞增生形成的瘢痕不利于移植MSCs的遷移。3.3動物源細胞毒性變化BBB評分法是評價脊髓損傷后大鼠后肢運動功能恢復過程的的主要方法之一,本實驗BBB評分結果顯示,各組大鼠移植前和移植后雙后肢運動功能的BBB評分分數有顯著性差異,