淺析登革病毒檢測技術的發展

感染登格病毒（denv）是人類最常見的病毒傳播。據who統計，目前世界上大約25億人感染了denv。生活在亞熱帶和亞熱帶的人的風險非常高。世界上每年大約有5000億新的denv患者。DENV屬于黃病毒科黃病毒屬,來源不明,是有包膜的單鏈RNA病毒,基因組全長約11kb,編碼核衣殼蛋白(C蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)這3個結構蛋白和7個非結構蛋白(NS蛋白),通常通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播,有4種抗原性不同的血清亞型,不同亞型的序列有65%~70%的同源性。任何一種亞型都能引起登革熱(denguefever,DF)、登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。大多數感染者無臨床癥狀,只有小部分會出現有癥狀感染,其中最常見的是DF,其臨床表現與感冒引發的急性高熱相似;嚴重的會有DHF,癥狀包括高熱、低血小板計數、出血和血管通透性增加;最嚴重的是以循環衰竭為特征、危及生命的DSS。DHF和DSS是DENV能引發的最嚴重癥狀,且在兒童和15歲以下青少年中更為常見。目前仍無針對DENV的有效疫苗上市,但早期發現和治療干預可降低其致死性,因此DENV檢測技術的研究對早期診斷治療、降低致死率具有極其重要的意義。1d或再次感染后4d內檢出者是否在檢測細胞外分離出病毒?DENV血癥可在發熱前2~3d至初次感染開始后5d或再次感染后4d內檢出,這段時間內患者的外周血、血清或血漿樣本都可分離出病毒。常用分離方法有敏感細胞培養分離、成年蚊蟲胸腔接種分離和乳鼠腦內接種分離。1.1率為“一般不穩定因素”的發生率蚊蟲胸腔內接種是敏感性最高的病毒分離方法,4種血清型DENV的分離率為71.5%~84.2%。病程早期(前4d)的樣本接種可獲得更高的分離率(85.3%),4d后分離率為65.4%,且初次感染病人的病毒分離率(91.0%)高于再次感染者(77.6%)。1.2老鼠腦移植出生2~4d乳鼠腦內注射病人血清或血漿樣本,每日觀察,在死前取腦分離DENV。1.3病毒分離法蚊蟲和乳鼠腦內接種分離病毒對技術、安全性和可行性要求高,花費也高,故敏感細胞系培養分離更加常用。常用的敏感細胞包括蚊蟲傳代細胞系,如白紋伊蚊細胞C6/36、偽盾伊蚊細胞AP-61、安波巨蚊細胞Tra-284、CLA-1蚊蟲細胞,或哺乳動物細胞LLC-MKZ、幼倉鼠腎細胞BHK21、Vero細胞、Vero-E6細胞等。細胞培養分離法的靈敏度只有約40.5%,且有少數毒株可能不引起細胞病變,此類病例不能通過細胞接種的方法檢出。除直接用于診斷外,病毒分離法還為體外實驗如基因測序、病毒中和及感染實驗提供病毒。病毒分離法診斷DENV的優點是可靠,適用于感染早期的疾病監測,缺點是耗時較長。因此,病毒分離法目前已極少用于臨床診斷。2免疫探索的試驗感染DENV后的急性期后期,血清學檢測是較好的方法。DENV的常用血清學檢測方法包括血凝抑制試驗(hemagglutinationinhibition,HI)、空斑減少中和試驗(plaquereductionneutralizationtest,PRNT)、間接免疫熒光抗體試驗(indirectimmunofluorescenceassay,IFA)、IgM/IgG捕獲ELISA法、補體結合試驗、免疫斑點試驗(dotimmune-bindingassay,DIBA)、免疫印跡和快速層析法。2.1血凝抑制試驗血凝抑制試驗敏感性高,重復性好,操作簡便,檢出率高于病毒分離法,曾是DENV血清學檢驗的金標準。此法的優點是試驗所需試劑配制方便,可根據血清滴度的不同判斷初次感染或二次感染,HI滴度≥1∶2560則為二次感染,<1∶2560則為初次感染。血凝抑制試驗也有諸多缺點:(1)待檢測的血清樣本必須先經預處理,以去除紅細胞凝集的非特異性抑制劑;(2)準確的HI測試需要急性期和恢復期的血清樣本,急性期和恢復期血清樣本的滴度相差4倍或以上才能確診近期感染;(3)方法缺少特異性,不能區別DENV感染和其他相近種類的病毒感染,如乙型腦炎病毒、西尼羅河病毒感染,因此在其他黃病毒感染也高發的地區使用受限;(4)易發生交叉反應且不能區分DENV的血清型。因此,血凝抑制試驗現已逐漸被其他更加快速準確的方法所取代。2.2prnt試驗空斑減少中和試驗可用于檢測感染過DENV的患者的血清分型。基本方法是在不同稀釋率的病人血清中加入定量的病毒,接種到預先準備好的單層細胞中培養數天,統計蝕斑數,計算該血清的蝕斑中和效價。最終滴度是使蝕斑減少50%~90%的血清的最高稀釋率。DENV初次感染者的血清能使蝕斑數減少90%。二次感染和抗體依賴性增強實驗中,PRNT試驗陽性反應中蝕斑減少50%~70%。PRNT是鑒別不同種類黃病毒的血清學檢查金標準。傳統PRNT法的缺點是耗時較長,需要活病毒,對操作人員技術要求高,且不能用于大量臨床或流行病學樣本的高通量分析。目前已有基于PRNT的改良法,使用偽病毒報告顆粒可有效檢測DENV的4種血清型。2.3igm/igg檢測此法的基本過程是以人抗IgM或IgG包被酶標板,病毒抗體、病毒抗原、二抗和酶按順序相互結合孵育,最后用分光光度計檢測顯色程度代表不同滴度。鼠腦來源的病毒血凝素抗原或細胞來源的病毒抗原都可作為病毒抗原使用,兩者的敏感性和特異性并無顯著差異。目前IgM/IgG捕獲ELISA法是判斷初次感染和再次感染的常用指標。目前已有多種商品化ELISA試劑盒可用于DENV抗體檢測,特異性和敏感性也很不錯。ELISA法的優點是操作方便迅速,IgM-ELISA可檢測出近期感染,IgM與IgG的吸光度比值可鑒別是初次還是二次感染。但ELISA法有2個缺點,一是血清中的風濕因子會影響DENVIgM的檢測特異性,二是ELISA法用全部病毒抗原來檢測登革特異性抗體,4個血清型之間易產生交叉反應。3denv的生物檢測方法與傳統的病毒分離法相比,分子生物學檢測方法的敏感性更高、更快速,十幾年來發展迅速,有良好的應用前景。3.1denv基因回復突變法依賴核酸序列的擴增技術(nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)是一種以RNA為模板進行等溫核酸擴增的方法,可用于DENV擴增。此法借助逆轉錄酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和2對特異性引物實現。這種化學發光法操作簡便,靈敏度為98.5%,特異性為100%,可檢測樣本中低于25PFU/mL的DENVRNA,適合在登革暴發地區快速檢測。3.2lamp的檢測環介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一種等溫擴增方法,其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物,不需要熱變性的DNA作為模板,在恒溫下就可高效、快速、高特異地擴增靶序列。利用鏈置換DNA聚合酶在等溫(63℃左右)條件下保溫30~60min即可完成核酸擴增反應。LAMP的結果判斷有多種方法,陽性產物電泳可見特殊的階梯狀條帶,或加入熒光染料觀察熒光強度,或顏色改變判斷是否為陽性反應,借助副產物焦磷酸鎂沉淀離心后產生白色沉淀,或通過濁度儀實現定量。該方法適合基礎條件較為薄弱的基層或現場實驗室,反應時間短,不需要特殊儀器設備,肉眼可觀察結果,具有很強的實用性。LAMP技術目前在國內外得到廣泛推廣及應用,RT-LAMP法可用于DENV檢測。3.3逆轉錄并pcr擴增轉錄介導的擴增方法(transcriptionmediatedamplification,TMA)是目標序列單鏈RNA在逆轉錄酶作用下,引物1引導進行逆轉錄,形成RNA/DNA雜交雙鏈分子,逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解后,引物2引導合成雙鏈DNA,由于在引物1上設計有T7啟動子結合區,雙鏈DNA在T7RNA多聚酶作用下轉錄出100~1000個目標RNA序列,這些RNA又可作為模板進行下一個循環,整個反應是一個自催化過程。TMA檢測DENVRNA在RT-PCR檢測陰性的急性期血清樣本中有80%的檢出率,在RT-PCR檢測陽性的急性期血清樣本中檢出率達100%,即總檢出率達89%。3.4rt-pcr和rflp法實時PCR(realtime-PCR,RT-PCR)是目前快速診斷DENV的最好方法之一,靈敏度范圍58.9%~100%,檢測閾0.1~3.0PFU[21,22,23,24,25,26,27]。RT-PCR的定量用熒光色素實現,目前常用的2種是能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結合的熒光探針如TaqMan探針,以及能在雙鏈DNA中插入的特異熒光色素如SYBRgreenⅠ。由于SYBRgreenⅠ可結合到任何雙鏈DNA,包括引物二聚體和非特異性產物上,影響目標產物的濃度檢測,因此對引物的要求較高。TaqMan熒光探針雜交法只能在單管mRNA上使用,試驗費用較高昂。RT-PCR引物來自DENV基因組的不同區域,可用于臨床檢測DENV及確定血清型。Lanciotti最早建立的兩步法巢式RT-PCR中,2組與C/prM區對應的引物比較常用,包含用于第一輪擴增的外引物及鑒定4種血清型的特異性引物。經過2次PCR擴增,病毒基因組的信息量擴大,有助于提高檢測的敏感性,方便檢出病毒,同時還可鑒定具體的血清型及分辨混合感染。為降低樣本交叉污染帶來的假陽性,Harris等建立了一種單管復式RT-PCR法,對1~4血清型DENV的最低檢測閾分別為1、50、1、30PFU。有研究證明一步法比兩步法具有更高的檢出率,值得臨床實驗室推廣。目前RT-PCR法和其他方法聯用診斷DENV越來越常見。如將一步法RT-PCR與單酶切-限制性片段長度多態性技術(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)相結合,可以更快速有效地鑒定DENV分型。Vorndam首先報道了RT-PCR/RFLP技術可鑒別DENV的地理亞群,但需要擴增整個病毒基因組。經Gaunt和Gould改進后,RT-PCR/RFLP法可鑒別90%的已知E基因序列的黃病毒。2012年Ortiz等建立了一種新的一步法RT-PCR與單酶RFLP法結合,只需24h就可鑒別DENV的4種血清型、黃熱病病毒、西尼羅河病毒和圣路易斯腦炎病毒,且特異性高于95%。由于PCR反應的引物、酶、緩沖液、反應條件、病毒的基因組靶區域和PCR儀都可能影響PCR結果,而各地的條件都不相同,因此很難界定哪一種分子生物學檢測方法更好,需要結合本地的實際條件加以應用。各種分子生物學檢測方法的標準尚未統一,需要進一步研究摸索,相關的分子學檢測試劑盒也正在開發。3.5材料和硬件的選擇生物傳感器是生物診斷設備,既可定性也可定量檢測,具有快速、靈敏、特異性高的優點,如能實現便于攜帶、自動化程度高的試劑盒商業化要求,將會有很好的應用前景。DENV生物傳感器在2000年開始出現,并不斷得到改進[34,35,36,37,38,39,40]。人類的基因組DNA可能會影響病毒RNA的選擇,因此生物樣本的純化和化學修飾十分重要。微流體設備(芯片實驗室)和基于一次性芯片的技術可用于樣本預處理,然而考慮到場地要求、設備要求和資金能力,這些設備可能不完全適于快速檢測試驗的基本要求。當前大多數DENV生物傳感器類型為壓電晶體生物傳感器、光生物傳感器和電化學生物傳感器。在壓電式傳感器中,2種不同的單克隆抗體固定在一個壓電式傳感器上,它們之間是一個免疫芯片,傳感器可探測糖蛋白E和非結構蛋白NS1,還有的使用分子印跡聚合物來識別登革病毒NS1蛋白的抗原決定部位。這樣的設計規避了合成單抗的使用,可獲得較高的靈敏度和特異性。最近,芯片技術發展為通過互補的寡核苷酸特異性雜交進行逆轉錄PCR,效果與RT-PCR相同。此方法易發生內源性和外源性互相干擾,因此對實驗設備的要求很高。一種化學發光的光學纖維免疫傳感器能與酶聯免疫吸附法獲得類似的DENV檢測效果,且靈敏度更高,或可用于無癥狀患者的