三種線蟲不同干燥裝置掃描電鏡比較研究

蠕蟲分類是研究有益昆蟲和有害昆蟲的基礎。掃描電子顯微鏡是線蟲分類研究中不可缺少的工具,它克服了光學顯微鏡分辨率受光波長限制的局限,可以觀察到比0.2μm更小的精細結構。在線蟲的掃描電鏡樣品制備中,若固定、脫水和干燥環節技術不當,會引起線蟲體表嚴重變形,從而影響觀察和鑒定結果。目前對斯氏科和異小桿科線蟲的掃描電鏡制樣技術研究和應用較多,而對一類新挖掘出來的、可用于生物防治的小桿科線蟲和植物線蟲研究較少。在斯氏科和異小桿科線蟲的掃描電鏡鑒定工作中,用戊二醛-鋨酸雙固定的方法固定線蟲,結合CO2臨界點干燥法,制備線蟲樣品,可以獲得較清晰的電鏡照片。關于小桿科線蟲,Stock曾用相同的方法對哥倫比亞小桿線蟲Rhabditis(Oscheius)colombianan.sp.進行嘗試,也得到較清晰的圖像。但是,對小桿科其它種的線蟲用上述方法是否可行,并且用近年來應用較多的真空冷凍干燥法是否更適合于小桿線蟲;另外,一些植物樣本的固定可以僅用戊二醛,不用劇毒的鋨酸,線蟲是否也可以僅用戊二醛固定。針對上述問題,本研究分別比較了戊二醛固定和戊二醛-鋨酸雙固定技術、CO2臨界點干燥和真空冷凍干燥技術及相互組合技術在線蟲掃描電鏡樣品制備中的應用,結果報道如下。1材料和方法1.1實驗線蟲本實驗室采集分離的小桿線蟲Tumian品系,三等齒屬無花果品系,根結線蟲。1.2使用設備KDQX-120型多槽式超聲波清洗機、GFD-320型真空冷凍干燥儀、日立S-3400N型掃描電子顯微鏡。1.3實驗方法1.3.1洗過將每種線蟲的成蟲約100條均勻挑入4個裝滿蒸餾水的1.5mL離心管中,分別記為1、2、3、4號樣品。樣品在超聲波中清洗10s。1.3.2離心管內的線蟲對4個離心管中的線蟲樣品分別進行4種處理。樣品1離心管中的線蟲用于處理1:戊二醛-鋨酸雙固定、真空冷凍干燥;樣品2離心管中的線蟲用于處理2:戊二醛-鋨酸雙固定、CO2臨界點干燥;樣品3離心管中的線蟲用于處理3:戊二醛固定、真空冷凍干燥;樣品4離心管中的線蟲用于處理4:戊二醛固定、CO2臨界點干燥。1.3.3固定1.3.3.酸溶液5%戊二醛將樣品1、2離心管中的線蟲挑入加有1mL磷酸緩沖液的工作室(圖1)中,每隔0.5h分別加入0.3mL、0.3mL和0.4mL的5%戊二醛,使線蟲充分浸入在終濃度為2.5%的固定液中,然后在通風櫥中逐滴加入2%的鋨酸直到完全浸沒線蟲,處理12h后緩沖液清洗。1.3.3.樣品處理和清洗將樣品3、4離心管中的線蟲挑入加有1mL磷酸緩沖液的工作室(圖1)中,每隔0.5h分別加入0.3mL、0.3mL和0.4mL的5%戊二醛,使線蟲充分浸入在終濃度為2.5%的固定液中。樣品處理24h后緩沖液清洗。上述步驟在4℃下進行。1.3.4脫水經不同處理的4個樣品依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%的酒精逐步脫水,每次15min,100%的酒精處理3次。1.3.5樣品處理與干燥樣品1、3離心管中的線蟲用叔丁醇溶液置換3次用于真空冷凍干燥法干燥,樣品2、4離心管中的線蟲用純乙酸異戊酯溶液置換3次用CO2臨界點干燥法干燥。1.3.6粘性臺噴金將干燥后的線蟲逐條用沾有指甲油的挑針粘在導電膠上,噴金。2小桿線蟲結構鑒定特征掃描電鏡下觀察顯示不同制樣方法獲得的圖像差異很大。對昆蟲線蟲的鑒定關鍵特征頭部乳突和身體側線,根結線蟲的鑒定特征會陰花紋比較如下經戊二醛-鋨酸雙固定、真空冷凍干燥處理的小桿線蟲和三等齒線蟲體飽滿,體表變形較小,表皮光滑。小桿線蟲頭部柱形口腔未變形,身體前端環紋可見,唇瓣、側唇瓣的內乳突和側感器清晰,且蟲體較干凈(圖2a);小桿線蟲的側線縱脊為3條,蟲體飽滿(圖3a)。三等齒線蟲口腔六個唇瓣各自分開明顯清晰,唇瓣乳突形狀圓形(圖4a);身體環紋清晰,側線4條~5條(圖5a)。經戊二醛-鋨酸雙固定、CO2臨界點干燥處理的小桿線蟲蟲體輕微變形,頭部有凹陷,體節環紋橫向皺縮,使得1個體節看似2個體節,具有骨化特征的口腔及柱形乳突結構清晰(圖2b);側線中部突出,整個側線布局能夠看清,但效果不如處理1的圖像(圖3b)。三等齒線蟲蟲體也有輕微皺縮,但是主要鑒定特征清晰明顯,頭部口腔及乳突特征完好(圖4b);側線兩邊凹陷,分布不均(圖5b)。而經戊二醛固定、真空冷凍干燥處理的小桿線蟲雖口腔乳突特征仍保留,體表卻嚴重皺縮(圖2c),側線特征徹底缺失,條數布局不清楚,側線變形擠到一起(圖3c)。三等齒線蟲頭部形態特征依稀可見,唇瓣分布清楚,但乳突特征缺失(圖4c),側線條紋走向清晰,身體環紋呈橫向凹陷(圖5c)。戊二醛固定、CO2臨界點干燥處理的線蟲頭部嚴重變形,口腔呈多邊形,致使乳突特征不明顯,呈蠟狀,側線特征缺失,褶皺厲害,不能分辨出側線走向。(圖2d、3d、4d、5d)。根結線蟲肛門和陰門周圍的角質膜形成的會陰花紋是分類的重要依據。經戊二醛-鋨酸雙固定、真空冷凍干燥處理的根結線蟲會陰花紋呈橢圓形,背弓中等到高,多為方形,背線平滑或稍有波浪,側線不明顯(圖6a)。經戊二醛-鋨酸雙固定、CO2臨界點干燥處理的線蟲鑒定特征不如前一處理清晰,陰門部位稍有褶皺(圖6b)。而不經鋨酸固定的后兩種處理線蟲陰門嚴重變形,鑒定特征缺失(圖6c、6d)。綜上所述,本實驗的研究結果表明在4個處理組合中,戊二醛-鋨酸雙固定與真空冷凍干燥組合(處理1)是制備線蟲掃描電鏡樣品的最佳方法;戊二醛-鋨酸雙固定與CO2臨界點干燥組合(處理2)次之,也為可行的方法。從本研究結果看(處理3、處理4),單一的戊二醛固定尚不能得到較好的線蟲電鏡樣本制備效果。3酸固定法:固定液及速沖劑為植物材料有試驗表明雙重固定的方式對某些組織的固定還不夠理想,但本研究證明鋨酸對小桿線蟲的固定步驟不可缺少,鋨酸能很好地固定脂肪,對生物組織有固定和染色雙重作用,避免了線蟲身體體表的變形。只用戊二醛固定的方法雖然適用于有些植物材料,但尚不適合線蟲的固定。至于加入鋨酸進行雙固定,是否可以適當減少鋨酸的使用量有待進一步研究,以減少鋨酸對人體和環境的毒性。為了減少戊二醛對組織細胞酶活性的破壞,固定時需在4℃下進行操作,所用器皿、器械及戊二醛固定液都需預冷,且固定過程中為了防止高濃度的固定液使線蟲