生防真菌淡紫擬青霉的研究與應(yīng)用

植物線條對(duì)許多作物都有嚴(yán)重的危害，并且可能導(dǎo)致顯著的收獲損失。對(duì)于植物線蟲的防治,歷來以化學(xué)藥劑為主,而化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重,使用過程中對(duì)人、畜也不安全,因此許多化學(xué)殺線劑己被禁用。淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus(Tham)Samson)是土壤及多種植物根系的習(xí)居菌,也是一些植物寄生線蟲的重要天敵。同時(shí),淡紫擬青霉的代謝產(chǎn)物對(duì)多種作物具有生理活性。1不同的營養(yǎng)條件對(duì)職業(yè)生長和產(chǎn)孢生長的影響淡紫擬青霉屬半知菌綱、絲孢菌目、擬青霉屬,在顯微鏡下觀察可見淡紫擬青霉分生孢子梗和分支比青霉菌分散,分生孢子梗成干燥的向基部鏈,形成指頭狀分支。單孢卵圓形到紡捶形,無色,在固體平板培養(yǎng)基上,會(huì)長出扁平,淡紫色的特征菌落。在液體震蕩培養(yǎng)條件下會(huì)形成菌球。溫度、光照和pH是影響生長發(fā)育的重要因子。淡紫擬青霉生長溫度范圍很寬,從8℃到38℃都可以生長,在15～30℃生長良好,最佳生長和產(chǎn)孢溫度為25～30℃,6℃和40℃時(shí)停止生長,35℃時(shí)停止產(chǎn)孢。由于該菌是土壤習(xí)居菌,光照對(duì)其生長和產(chǎn)孢有一定的抑制作用,所以在完全黑暗條件下生長最佳,其次是黑暗和光亮交替,在光亮中也能生長。pH在2～12均能生長,菌絲生長最佳pH為6～9,產(chǎn)孢最佳pH為4～6,這樣的廣譜適宜溫度和pH范圍,使其在農(nóng)業(yè)土壤中成為有競爭力的生物。淡紫擬青霉?fàn)I養(yǎng)要求不高,碳水化合物、有機(jī)酸及低級(jí)醇類都可以作為其培養(yǎng)的碳源,其中以二糖為最佳;氮源可以是有機(jī)氮,也可以是NaNO3、NH4NO3等無機(jī)氮化合物。王明祖研究淡紫擬青霉在土壤浸出液瓊脂培養(yǎng)基、豬糞浸出液培養(yǎng)基、玉米瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯、蛋白胨等培養(yǎng)基上的生長情況,認(rèn)為馬鈴薯、蛋白胨、蔗糖、硝酸鈣、磷酸氫二鈉組成的培養(yǎng)基和豬糞浸出液瓊脂培養(yǎng)基有利于該菌的營養(yǎng)生長。潘滄桑用麥芽糟、廢啤酒酵母等作為培養(yǎng)基培養(yǎng)淡紫擬青霉,肉眼可見菌絲在麥芽粒之間生長茂盛,孢子含量為3.4×106CFU/g樣品,淡紫擬青霉還能以多種農(nóng)副產(chǎn)品為基質(zhì)進(jìn)行生長,如稻米、稻殼、麥粒、麥谷、玉米、綠豆、甘蔗、玉米穗軸;該菌也可以在糖廠廢料中的糖蜜及甘蔗渣組成的培養(yǎng)基及米糠、豆渣上也能快速生長。另外,在許多廉價(jià)材料如:切碎的睡蓮、馬鈴薯槳,甚至剩飯、西瓜皮、菠蘿皮等多種果皮制成的培養(yǎng)基上也能良好的生長。用多種植物的葉片或幼嫩的莖作基質(zhì)培養(yǎng)該菌,均有很高的產(chǎn)孢量。這些都對(duì)該菌的大規(guī)模化生產(chǎn)有參考意義。培養(yǎng)基中添加一定的NaCl或磷酸鹽,以及一些植物油濾渣(如芝麻、棉籽)等都能夠明顯地促進(jìn)菌絲的生長,提高產(chǎn)孢。孫漫紅等同時(shí)發(fā)現(xiàn),Zn2+、Ca2+對(duì)淡紫擬青霉菌絲生長、分生孢子的形成具有顯著的促進(jìn)作用,一些維生素,如肌醇、葉酸、核黃素等促生效果也十分突出。2目前的研究和應(yīng)用2.1淡水紫紫擬青霉的生物生物防治根結(jié)線蟲是植物根系定居性內(nèi)寄生線蟲,對(duì)番茄、黃瓜和辣椒等重要蔬菜的生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害,發(fā)病田常年減產(chǎn)15%～20%,嚴(yán)重時(shí)達(dá)到70%以上。淡紫擬青霉能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶,并通過這兩種酶的作用破壞根結(jié)線蟲卵殼,從而菌絲侵入根結(jié)線蟲的卵并寄生于卵內(nèi),因此淡紫擬青霉菌株被認(rèn)為是最具有應(yīng)用前景的線蟲生防真菌。淡紫擬青霉可以適應(yīng)不同的氣候條件,因此寄主范圍較廣泛,能寄生多種植物寄生線蟲,如根結(jié)線蟲(Metoidogynespp.)、胞囊線蟲(Heteroderaspp.)、腎形線蟲(Rotylenchulusspp.)、半穿刺線蟲(Tylenchulusspp.)[l8]和馬鈴薯金線蟲(Gtoboderarostochiensis)等,同時(shí)也能寄生人和動(dòng)物(羅非魚)的組織和一些昆蟲如荔枝蝽蟓體內(nèi)。隨著對(duì)淡紫擬青霉生防價(jià)值的重要性的不斷認(rèn)識(shí),國內(nèi)外很多研究人員對(duì)這種生防菌的生物防治應(yīng)用作了廣泛研究。Davide等人用淡紫擬青霉浸薯塊或直接將菌劑施入土中防治馬鈴薯金線蟲(Globoclerarestrochiensis),施用菌劑后馬鈴薯增產(chǎn)20.3%～36.5%;防治秋葵根結(jié)線蟲,施菌三個(gè)月后,線蟲比對(duì)照減少66%～77%,莢數(shù)增加39%～41%,重量增加45%～54%,防治效果與呋喃丹或滅克靈相仿。多年實(shí)踐證明,淡紫擬青霉對(duì)多種線蟲都有防治效能,其寄主有根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、金色線蟲、異皮線蟲,是防治根結(jié)線蟲最有前途的生防制劑。由于該菌可適應(yīng)不同的氣候條件,對(duì)線蟲卵具有較高的寄生率,可以有效控制土壤線蟲數(shù)量,明顯減少危害,已被廣泛用于生產(chǎn)實(shí)踐中。目前,世界近70個(gè)國家的線蟲學(xué)家用它來防治根結(jié)線蟲、胞囊線蟲等植物寄生線蟲,并取得了較好的防效。近年來,我國研究者也對(duì)該菌做了大量的生防研究,亦證實(shí)該菌對(duì)根結(jié)線蟲有較高的寄生率,能有效控制土壤中根結(jié)線蟲的數(shù)量,明顯減少危害。李芳用盆栽試驗(yàn)研究淡紫擬青霉對(duì)煙草根結(jié)線蟲的防治效果及其對(duì)煙草植株生長的影響。結(jié)果表明,土壤中二齡線蟲減少76.3%,根結(jié)指數(shù)下降43.6%,煙株根生長量增加153.7%,地上部分鮮重增加44.4%。有研究證實(shí)淡紫擬青霉對(duì)南方根結(jié)線蟲卵有90%以上的寄生率,盆栽、田間防治均使線蟲率降低,植株生長狀況好于未處理組,菌劑的防治效果高于殺線劑益舒寶(ethoprophos)劑量為4.5g/m2的處理,對(duì)植物寄生線蟲都具顯著的防治效果。該菌寄生番茄南方根結(jié)線蟲的卵,能夠有效抑制煙草根結(jié)線蟲的發(fā)生并促進(jìn)植物生長,施用菌劑的植株病情指數(shù)比對(duì)照下降34%。對(duì)大豆孢囊線蟲的防效不但當(dāng)年達(dá)到45%～69%,而且第二年和第三年仍然分別達(dá)到22.5%～37.7%和7.7%～22.9%,這也說明了淡紫擬青霉具有較好的后效作用。楊樹軍等測定了淡紫擬青霉DZ1菌株對(duì)云南煙草根結(jié)線蟲南方根結(jié)線蟲卵囊和分散卵孵化的影響,DZ1對(duì)分散卵的相對(duì)抑制率達(dá)57.18%,對(duì)卵囊孵化相對(duì)抑制率達(dá)60.38%。2.2淡紫擬青霉對(duì)根結(jié)線蟲幼蟲的抑殺作用淡紫擬青霉能夠通過多種方式作用侵染根結(jié)線蟲等植物寄生線蟲,既可以通過物理方式寄生線蟲的卵和孢囊,也可以在侵染線蟲過程中通過機(jī)械壓力和分泌的胞外酶聯(lián)合作用,或產(chǎn)生毒性代謝物質(zhì)麻痹毒殺線蟲,促進(jìn)菌物在線蟲寄主上定植和獲取營養(yǎng)。真菌孢子附著在寄主蟲體和卵殼上分泌幾丁質(zhì)酶加速蟲體表和卵殼的分解,或使幼蟲早產(chǎn),提高幼蟲死亡率。華靜月研究認(rèn)為的淡紫擬青霉與線蟲的孢囊或卵接觸后,在黏性基質(zhì)中生長菌絲,并纏卷整個(gè)卵,菌絲末端變粗,由于外源性代謝和真菌幾丁質(zhì)酶的活動(dòng)結(jié)果,在卵殼中發(fā)生了一系列超微結(jié)構(gòu)變化,使卵殼表皮破裂,隨之真菌穿入而寄生于早期胚胎發(fā)育階段的卵,影響其正常發(fā)育。肖炎農(nóng)通過一系列試驗(yàn)研究結(jié)果證明淡紫擬青霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能直接促進(jìn)根結(jié)線蟲卵的孵化,其孵化率與酶的濃度呈正相關(guān),該酶對(duì)根結(jié)線蟲幼蟲有一定的致死作用。從發(fā)酵液中得到的部分純化的蛋白酶的分子量為33.5kDa,最適反應(yīng)pH和溫度分別為10.3和60℃,蛋白酶的活性被苯甲磺酰氟(PMSF)完全抑制。通過延時(shí)顯微鏡(time-lapsemicroscopy)觀察發(fā)現(xiàn)純酶和線蟲卵一起孵化,酶能使線蟲的卵漂浮起來;卵的孵化受到嚴(yán)重影響,不成熟的卵更容易受到純酶的影響,然而純酶對(duì)幼蟲沒有明顯的影響,說明淡紫擬青霉產(chǎn)生的胞外絲氨酸蛋白酶可能在線蟲卵的穿透過程中起作用。這與孫漫紅的實(shí)驗(yàn)結(jié)論即淡紫擬青霉M-14菌株發(fā)酵濾液對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲有較強(qiáng)的抑殺作用,毒性成分是一種蛋白酶相一致。Khan等用透射電鏡觀察淡紫擬青霉產(chǎn)生的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶作用于爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)卵的過程,發(fā)現(xiàn)用蛋白酶和幾丁質(zhì)酶單獨(dú)或聯(lián)合處理都能夠改變卵殼的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過蛋白酶處理以后的線蟲卵,其脂質(zhì)層消失,幾丁質(zhì)層變薄;用幾丁質(zhì)酶處理的線蟲卵,其幾丁質(zhì)層中出現(xiàn)大的空泡,卵黃層開裂并失去完整性。進(jìn)一步研究表明,單獨(dú)或者聯(lián)合用淡紫擬青霉產(chǎn)生的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶處理根結(jié)線蟲的卵都能有效降低根結(jié)線蟲卵孵化成幼蟲,然而商品化的細(xì)菌幾丁質(zhì)酶卻能夠增強(qiáng)孵化率。淡紫擬青霉還能分泌具殺線蟲活性的毒素類物質(zhì),Park在淡紫擬青霉發(fā)酵液中檢測到白灰制菌素(Leucinostatin)的產(chǎn)生,并且具有殺線蟲活性。淡紫擬青霉侵染線蟲過程十分復(fù)雜,可能是機(jī)械力與多種酶共同作用的結(jié)果。關(guān)于淡紫擬青霉的致病機(jī)理亦受到多方面因素的影響,如還涉及到識(shí)別機(jī)制。其識(shí)別機(jī)制可能與淡紫擬青霉寄生相關(guān)基因有關(guān),受識(shí)別信號(hào)刺激,細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致菌絲形態(tài)的改變并分泌胞外水解酶進(jìn)而進(jìn)行侵染。淡紫擬青霉又可能受培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的影響或受代謝產(chǎn)物的反饋抑制進(jìn)而侵染線蟲。3及其產(chǎn)物的降解功能淡紫擬青霉可寄生半翅日的荔枝蝽蟓、稻黑蝽;同翅目的葉蟬、褐飛虱;等翅目的白蟻;鞘翅目的甘薯象鼻蟲、鱗翅目的茶蠶、燈蛾;還有雙翅目的伊蚊等。在擬青霉的培養(yǎng)過程中,特別是在特殊培養(yǎng)基與深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中,淡紫擬青霉能分泌對(duì)線蟲起毒殺作用的毒素,Djian-C從擬青霉的發(fā)酵液中分離出特異性的殺線蟲活性代謝物,利用液相色譜法可純化出醋酸類物質(zhì),這種物質(zhì)只有在羧化結(jié)構(gòu)中才對(duì)線蟲有毒性,線蟲的不同幾丁質(zhì)區(qū)對(duì)醋酸有選擇滲透能力。該菌能產(chǎn)生豐富的類似吲哚乙酸的產(chǎn)物,最顯著的生理功效是低濃度菌液促進(jìn)植物根系與植株的生長,高濃度抑制植株的生長,根據(jù)此特性有可能開發(fā)天然抑草劑或催芽劑。該菌能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶促進(jìn)細(xì)胞分裂,幾丁質(zhì)酶對(duì)幾丁質(zhì)有降解作用,能促進(jìn)線蟲卵的孵化、提高擬青霉菌對(duì)線蟲的寄生率,此外它還能產(chǎn)生細(xì)胞裂解酶、葡聚糖酶與絲蛋自酶。有研究表明,在高效菌株中,蛋白酶、葡聚糖酶和淀粉酶活性高出1.2～4.2和20～120倍,這些酶能促進(jìn)細(xì)胞分裂。該菌能產(chǎn)生抑菌代謝物。淡紫擬青霉對(duì)多種植物病原菌具有拮抗活性,王明祖的研究表明,淡紫擬青霉菌株36-1對(duì)玉米小斑病、小麥赤霉病、棉花枯萎病、水稻惡菌病、水稻紋枯病、柑桔青霉病菌、柑桔綠霉菌、黃瓜炭疽病菌這8種植物病原菌有顯著拮抗活性。Abdul利用淡紫擬青霉、厚壁輪枝菌及糠樹提取物60EC控制棉花細(xì)菌性枯萎病與棉花病毒病,結(jié)果表明,擬青霉菌能明顯降低棉花(NIAB-18、CIM-240品種)的病毒性病害,并有效抑制細(xì)菌性枯萎病。相關(guān)研究還證實(shí)淡紫擬青霉能顯著降低向日葵和納豆根癌病的發(fā)病率,并且能抑制由鐮孢菌屬引起的蕃茄根腐病。研究人員還從溫室中篩選出高拮抗力菌株,噴灑在小麥葉片上,用以控制小麥葉斑病。淡紫擬青霉具有降解效應(yīng):Somaskenar研究發(fā)現(xiàn),淡紫擬青霉能促進(jìn)難溶磷酸鹽的溶解,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn),擬青霉菌的增溶效果達(dá)30%,其它線蟲拮抗菌達(dá)到20%～40%。同類研究還表明,擬青霉還能促進(jìn)許多化學(xué)聚合物(如有機(jī)磷農(nóng)藥,制革廢水等)的分解。4研究淡紫擬青霉伴生代謝多樣性的意義真菌通過營養(yǎng)菌絲形成捕食器官捕食線蟲,或通過內(nèi)寄生方式消解線蟲,分泌毒素毒殺線蟲,這些食線蟲真菌是線蟲生防的重要材料。第一代線蟲生防菌劑是活菌體,其作用機(jī)理是菌絲侵入線蟲體內(nèi)導(dǎo)致寄土死亡,由于土壤存在不同程度的抑菌現(xiàn)象導(dǎo)致菌劑在不同地域使用穩(wěn)定性不一致,這是活菌劑的通病。因此有必要從生防菌次生代謝物中尋找具有活性的物質(zhì)。諸多研究表明淡紫擬青霉確實(shí)是一種非常有價(jià)值的生防菌。長期以來,傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥使用導(dǎo)致害蟲和病菌耐藥性、抗藥性產(chǎn)生,農(nóng)藥殘留,環(huán)境污染等一系列問題。近年來隨著人們環(huán)境意識(shí)的加強(qiáng),微生物農(nóng)藥的研發(fā)越來越受到重視。次生代謝的一個(gè)重要特征是其代謝產(chǎn)物一般只在菌體的生長速率降低時(shí)才合成。真菌次生代謝物一般是在生長后期合成的化合物,次生代謝受總代謝調(diào)控。次生代謝物包括大多數(shù)的抗生素、生物堿和微生物毒素。深入研究淡紫擬青霉次生代謝物具有現(xiàn)實(shí)和理論多重意義:(1)深入了解菌物代謝多樣性,為淡