乳酸菌在飼料添加劑中的應用

蘑菇可以分解脂肪酸，形成硫酸，無發(fā)芽。革蘭氏陽性，厭氧或選擇性厭氧生長，穩(wěn)定性低，耐酸性，在ph3.0.4.5時成熟，適合胃部環(huán)境。乳酸菌在飼料添加劑中具有重要地位。在美國FDA公布的42種微生物中有近30%是乳酸菌類。乳酸菌是魚腸道中的正常菌群,能在魚腸道中定植,阻止和抑制有害物質,增強抗感染能力。乳酸桿菌能合成動物所需要的多種維生素,如B1、B2、B6、B12、煙酸、泛酸、葉酸等。乳酸菌在動物體內(nèi)通過拮抗降低pH,阻止和防止致病菌的侵入和定植,維持腸道內(nèi)的生態(tài)平衡;降解動物體內(nèi)亞硝酸胺、氨、糞臭素等有害物質;活菌體和其代謝產(chǎn)物中含有較高的超氧化物歧化酶(SOD),能消除氧自由基的不利作用,增強體液免疫和細胞免疫,增強機體調節(jié)活性,促進生長。但該菌在生長過程中不形成芽孢,抗逆性差,易失活而難于保藏,所以,在飼料中的添加使用受到一定限制。目前,有些市場上銷售的產(chǎn)品采用微膠囊技術包被,提高了其對環(huán)境的適應性和抗逆性,但成本較高。乳酸菌是魚腸道內(nèi)的正常菌群,其數(shù)量與營養(yǎng)、環(huán)境因素有關,如不飽和脂肪酸攝入量、鹽分、氧化鉻等均會影響腸道內(nèi)乳酸菌的存在數(shù)量,飼料的種類和季節(jié)因素也會影響到魚腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量。乳酸菌在魚腸道內(nèi)定植,可以抵抗革蘭氏陰性致病菌,增強魚抗感染能力,增強機體腸粘膜的免疫調節(jié)活性,促進生長。Gildberg等人用含有乳酸菌的飼料飼養(yǎng)鱈魚和保加利亞乳酸桿菌飼養(yǎng)輪蟲與鹵蟲后作為大菱鲆幼魚的餌料,可使輪蟲和鹵蟲的存活率較對照組有顯著提高。一、對腸道生長的影響粘附是細菌的重要生理活動,尤其是益生菌對病菌的粘附抑制作用,可以有效地降低病原菌在腸道內(nèi)的增殖,從而平衡腸道微生態(tài)系統(tǒng)。丁酸梭菌(Clostridiumbutyocum)又名酪酸菌、宮入菌。是一種嚴格厭氧的芽孢菌,最早發(fā)現(xiàn)于日本,作為益生菌常用來防治人和動物的腹瀉、腸炎等疾病。丁酸梭菌能抑制產(chǎn)生毒素的大腸桿菌、艱難梭菌、幽門螺旋桿菌、弧菌等多種致病菌,還能顯著促進雙歧桿菌等腸道有益菌的生長;而且,丁酸梭菌能形成芽孢,具有抗高溫、抗膽酸鹽等特性,作為飼料添加劑和獸藥具有非常廣闊的開發(fā)應用前景。Motomichi.T等人的研究表明,丁酸梭菌能夠粘附于Caco-2細胞,抑制大腸桿0157∶H7的粘附。但有關丁酸梭菌對魚腸上皮細胞的粘附及對水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌的抑制作用尚未見報道。為此,浙江大學動物科學學院等單位的宋增福等人研究了丁酸梭菌對腸道上皮細胞粘附及對鰻弧菌抑制作用,該項研究以鰻弧菌(Aibrioanguillarum)為對照,以分離出來的鯽魚腸道上皮細胞為模型,研究丁酸梭菌對魚腸道上皮細胞的粘附作用及粘附對細胞的損傷和成活率的影響等。結果顯示,丁酸梭菌對魚腸道上皮的粘附率為7.39±1.85,低于鰻弧菌(P<0.05);對細胞的損傷率為1.02±0.35,也顯著低于鰻弧菌對細胞的損傷率;粘附后丁酸梭菌組對細胞的成活率的影響與正常對照組比較,差異不明顯;當酪梭菌、鰻弧菌與腸道上皮細胞共同培養(yǎng)時,使鰻弧菌的粘附率下降7.03%(P<0.05)。由此可見,該株丁酸梭菌可以安全地粘附于魚腸道上皮細胞,并能有效抑制鰻弧菌的粘附。(一)細胞培養(yǎng)和活性試驗動物為體重10g左右的鯽魚。細菌為丁酸梭菌和鰻弧菌。將丁酸和的凍干粉接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的小三角燒瓶中,裝量為90mL,放置于28℃的二氧化碳工作站中,靜止厭氧培養(yǎng)24小時。鰻弧菌斜面轉接三角瓶中的營養(yǎng)肉汁液體培養(yǎng)基,放置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中,普通培養(yǎng)24小時。用血球計數(shù)板計數(shù),調整各菌液濃度為1×108細胞/mL(CUF/mL),放于4℃的冰箱中備用。細菌粘附率的測定:參照Guzman-Murillo等(2000)原代培養(yǎng)鯽魚腸道上皮細胞的方法,并加以改進。采樣前后用抗生素處理魚體,采用膠原蛋白酶Ⅰ型和Ⅳ型、EDTA、消化腸道組織,依據(jù)各細胞貼壁時間的不同純化腸道上皮細胞。細胞培養(yǎng)用含5%胎牛血清的DMEM作為細胞的培養(yǎng)液,在28℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),供以5%的二氧化碳。細胞粘附率的測定:參照Isabelle等(2005)方法,采用平板活菌計數(shù)法測定丁酸菌、鰻弧菌對魚腸道上皮細胞的粘附率。將原代培養(yǎng)的細胞以1×105細胞/mL濃度接種于24孔的培養(yǎng)板上,放置于28℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中,供以5%的二氧化碳培養(yǎng)。待細胞呈單層生長時,輔滿培養(yǎng)板底壁后分成兩組。試驗組每孔加入500μL丁酸菌(1×108CUF/mL),對照組每孔加入500μL鰻弧菌(1×108CUF/mL),各重復12孔,繼續(xù)培養(yǎng)1.5小時。然后用Hanks液輕輕沖洗6次,洗去未粘附的細菌,加入含1%的TritonX-100的PSB0.2mL于各孔,混勻置于室溫下10分鐘,使其釋放粘附的細菌;再加入PSB0.8mL終止反應。然后吸出各孔懸液,用無菌生理鹽水100mL稀釋。平板活菌計數(shù)法測定細菌數(shù)。粘附率的計算:粘附對細胞損傷的測定:細胞接種培養(yǎng)同細菌粘附率的測定。待細胞呈單層生長,鋪滿培養(yǎng)板底壁后分成兩組。試驗組每孔加入500μL的丁酸梭菌(1×108CUF/mL),對照組每孔加入500μL鰻弧菌(1×108CUF/mL),各重復12孔,繼續(xù)培養(yǎng)1.5小時。然后吸取各孔培養(yǎng)懸液并分別離心10分鐘,離心機轉速為3000轉/分(r/min),取上清液。用全自動系列化分析儀測定上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量。另取魚上皮細胞懸液1mL,與含1%的TritonX100混勻,裂解細胞,離心取上清液測定乳酸脫氫酶(LDH)含量,并定為最大釋放量,具體方法參照Konjevic等(1997)。按下列公式計算出丁酸梭菌和鰻弧菌粘附對魚腸道上皮細胞的損傷活性。細胞存活率的測定:采用臺盼藍排除檢測法測定細胞存活率。將細胞的接種培養(yǎng)同前述試驗。待細胞呈單層生長,鋪滿培養(yǎng)板底壁后,分成3組。試驗組每孔加入500μL丁酸梭菌(1×108CUF/mL);對照組每孔加入500μL鰻弧菌(1×108CUF/mL);另設正常對照組,兩種菌都不添加;各組重復12孔,繼續(xù)培養(yǎng)。在1小時、3小時和6小時的3個不同培養(yǎng)時間段,各孔加入0.25%胰蛋白酶消化單層細胞,待看到細胞形態(tài)改變后,立即加入胎牛血清中止反應,制成細胞懸液。吸取20μL懸液和等量的2%臺盼藍液混合,滴到細胞計數(shù)板上,在顯微鏡下計數(shù)200個細胞,呈藍色的為死細胞,活細胞未著色,計算存活率。丁酸梭菌抑制鰻弧菌粘附:參照ChritianeForenstier等(2001)方法,將細胞原代于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),細胞貼壁且呈現(xiàn)單層狀生長。待細胞鋪滿培養(yǎng)板后分成2組。對照組每孔只加入500μL濃度1×108CUF/mL的鰻弧菌,試驗組加入500μL濃度1×108CUF/mL丁酸梭菌和500μL濃度1×108CUF/mL的鰻弧菌共同孵育;各重復12孔,培養(yǎng)60分鐘。然后用PBS(一種表面活性物質,起洗滌作用)輕洗3次,洗去未粘附的細菌;加入含1%的TritonX-100PBS0.8mL終止反應,吸出各孔懸液,用無菌生理鹽水稀釋100倍。營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基平板活菌計數(shù)法測定鰻弧菌數(shù)。數(shù)據(jù)分析:試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用MicrosoftExcel2003處理,用t檢驗進行顯著性比較,顯著水平設為α=0.05。(二)腸道上皮細胞的存活率丁酸梭菌能夠粘附于魚腸道上皮,其粘附率為7.39%,顯著低于鰻弧菌13.51%的粘附率。丁酸梭菌粘附于細胞后,LDH的釋放和細胞損傷率均顯著低于鰻弧菌組。腸道上皮細胞在分別加入丁酸梭菌和鯤弧菌后,細胞的存活率表現(xiàn)有所不同:正常對照組的細胞數(shù)量基本沒有變化;而加入丁酸梭菌組在60小時以內(nèi)的細胞存活率略微下降;加入鰻弧菌后,1小時內(nèi)細胞存活率下降顯著,較正常對照組減少了18.6%,并隨著時間的延長,細胞的存活率越低。當丁酸梭菌、鰻弧菌共同孵育粘附于上皮細胞時,丁酸梭菌能顯著抑制鰻弧菌粘附細胞,粘附率低于7.03%。二、嗜乳酸桿菌(一)細菌形態(tài)、理化特性嗜乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)最初是從幼兒糞便中分離得到的,火雞、小雞和小鼠的口腔及陰道中也存在。常用的菌種有ATCC11506、ATCC11749、ATCC13650、ATCC13651和ATCC13652等。菌株為桿狀,兩端圓形,通常為0.6μm~0.9μm×1.5μm~6.0μm。呈現(xiàn)單個、成雙或短鏈出現(xiàn)。不運動,無鞭毛。菌落通常粗糙,在顯微鏡下觀察,一般顯示纏繞或絨毛狀,從暗影的菌堆的中心放射伸出。深層菌落呈發(fā)射或分枝的不規(guī)則形狀。無特定的色素。革蘭氏陽性。生長最適溫度為35℃~38℃,最低溫度為15℃,最適pH5.5~6.0。兼性厭氧,接觸酶陰性。細胞壁通常缺少磷壁酸,在某些菌株中可測出少量的甘油磷壁酸,細胞中不含有任何可鑒別的已糖和戊糖。精氨酸不產(chǎn)氨,牛奶產(chǎn)酸和凝固的特性是可變的,可產(chǎn)0.3%~1.9%乳酸。乳酸旋光性為DL型,菌體DNA的G+C含量為36.7±0.7mol%。其有效成分活性嗜乳酸桿菌。嗜乳酸桿菌在生長中可以產(chǎn)生一些抑菌物質,如有機酸。細菌素和類細菌素可以抑制腸道中有害微生物的生長繁殖(如致病性大腸桿菌和金色葡萄球菌),能殺滅許多有害細菌,如白色念球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯肺炎球菌、痢疾志賀菌、金以葡萄球菌、藤黃八疊球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等,起到平衡腸道菌群的作用;并能產(chǎn)生B族維生素,包括葉酸、生物素、維生素B6和K等,分泌各種有益物質,如乳酸、乙酸等,降低腸道pH值。(二)牛肉提取物的制備可參照《工業(yè)微生物實驗技術手冊》和《伯杰細菌鑒別手冊》提供的方法進行種類鑒別。根據(jù)細菌的生化特征進行鑒別。鑒別用MRS培養(yǎng)基的組成為:酪蛋白胨10g牛肉提取物10g乙酸鈉5g酵母浸粉5g葡萄糖5g磷酸氫二鉀2g瓊脂15g吐溫1.0mL純化水1000mL調整pH至6.2~6.4,121℃滅菌15分鐘~20分鐘。經(jīng)過2次活化的菌種接種于pH分別調整至1.5、2.5、3.5、4.5及膽汁分別調整到0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的MRS培養(yǎng)基中,在37℃條件下培養(yǎng),每隔一定時間采取無菌生理鹽水以10倍遞減依次稀釋進行平板菌落計數(shù)。(三)嗜乳酸桿菌藥此菌的制劑一般用于添加于飼料或飲用水中。在飼料中的添加量為1×108cfu/kg。一般不與抗生素合用,不則會降低應用效果,甚至誘導嗜乳酸桿菌產(chǎn)生耐藥性。其制劑產(chǎn)品中一般含有1×108cfu/g(mL)活菌數(shù)。貯存于陰涼、通風和干燥處。三、關于蘑菇的應用的研究(一)乳酸桿菌lh代謝產(chǎn)物的抑菌活性為探明乳酸桿菌LH對水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的生物防治功能,周海平等人(2006)對此進行了研究,采用試管稀釋法和平板抑菌檢測法,控計了乳酸菌LH代謝產(chǎn)物對沙蠶弧菌(Vibrionereis)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vivrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Vib-rioparahaemolyticus)、漂浮弧菌(Vibrionatriegen)的抑制能力,并在模擬養(yǎng)殖水體實驗中探討了乳酸桿菌LH對哈維氏弧菌的抑制效果,結果顯示,乳酸桿菌LH培養(yǎng)12小時的代謝產(chǎn)物沒有抑菌活性,培養(yǎng)24小時~96小時的代謝產(chǎn)物有明顯的抑菌活性,隨著培養(yǎng)時間的延長,其代謝產(chǎn)物的抑菌作用活性增強;乳酸桿菌LH代謝產(chǎn)物對病原弧菌的最低抑菌濃度為8倍稀釋液;在模擬養(yǎng)殖水體中,10個/cm乳酸桿菌LH即對哈維氏弧菌有明顯的抑制作用,抑制作用隨哈維氏弧菌量的增大而減弱。(二)水體和牙腸道好氧性異養(yǎng)菌總數(shù)、總弧菌數(shù)和乳酸菌數(shù)陳營等人進行了乳酸菌對牙鲆稚魚養(yǎng)殖水體和腸道菌群和影響研究。在牙鲆稚魚的飼養(yǎng)過程中投喂添加有單一鼠李糖乳酸桿菌P15制備的微生態(tài)制劑和黃霉素,在60天的投喂試驗期間,采用平板計數(shù)法檢測好氧性異養(yǎng)菌總數(shù)、總弧菌數(shù)和乳酸菌的數(shù)量。結果表明,在投喂菌液和凍干粉后,養(yǎng)殖水體和牙鲆腸道的乳酸菌數(shù)呈上升趨勢,在30天后,甩酸菌的數(shù)量達到穩(wěn)定并在腸道內(nèi)定植。同時,由于乳酸菌的抑制作用,弧菌的數(shù)量下降,以腸道這的弧菌最為