宮頸癌組織凋亡相關蛋白survilin、fas、fasl表達與臨床病理對照研究

死亡不僅在正常的生理調整中起著重要作用，而且在惡意病變的過程中也起著重要作用。細胞凋亡過程受凋亡抑制基因與凋亡活化基因的共同調節。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)的家族成員,具有明確的抗凋亡作用。Fas是促進細胞凋亡的信號分子。Fas/FasL屬于TNF/NGF受體家族,FasL與Fas的交聯及信號轉導在誘發細胞凋亡、維持機體自身穩定和保持內環境平衡等方面起著重要的作用。Fas與自然存在的FasL結合將啟動凋亡信號,導致Fas陽性細胞在數小時內凋亡。Survivin與Fas共同作用于在凋亡通路中發揮決定作用的Caspase3和Caspase7。本研究擬觀察Survivin和Fas/FasL系統在正常宮頸、慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤樣變(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)和宮頸癌中的表達及其在宮頸癌發生、發展過程中的臨床意義。1數據和方法1.1患者年齡分布宮頸組織標本取自上海交通大學附屬第一人民醫院婦產科2001年1月—2008年12月行子宮手術或宮頸活檢者,標本均經病理科醫師復閱HE染色切片證實;其中宮頸癌47例,CIN25例,慢性宮頸炎20例,正常宮頸組織標本20例。47例宮頸癌患者的年齡為25～52歲,中位年齡38歲;鱗癌42例,腺癌5例;按分化程度為高分化15例,中分化29例,低分化或未分化3例;臨床分期(FIGO,2000)為Ⅰa期5例,Ⅰb～Ⅱa期39例,Ⅱb～Ⅲ期3例;有淋巴結轉移30例,未轉移17例(完成手術者經病理檢查診斷,未手術者根據MRI診斷)。所有患者術前均無放療和化療史。20例CIN患者的年齡為25～49歲,中位年齡37歲;CINⅠ級9例,CINⅡ級11例,CINⅢ級5例。20例慢性宮頸炎患者的年齡為30～55歲,中位年齡42歲。20例正常宮頸者的年齡為25～51歲,中位年齡38歲。各組間年齡分布差異無統計學意義(P>0.05)。1.2實驗試劑與方法宮頸組織標本做4μm連續切片,行免疫組織化學染色(SP法)。一抗Survivin兔抗人多克隆抗體、Fas兔抗人多克隆抗體、FasL兔抗人多克隆抗體均為美國SantaCruz公司產品;通用型免疫組織化學試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。一抗工作濃度均為1∶100。實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。石蠟切片脫蠟,以微波枸櫞酸鹽進行抗原修復,DAB顯色,蘇木精復染,脫水、透明、封片,光學顯微鏡下觀察。用已知的陽性乳腺癌切片作為陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。1.3半定量分析結果切片經病理科醫師證實有抗原表達及定位,Survivin、Fas和FasL均以出現棕黃色顆粒為陽性細胞。高倍鏡(×400)下綜合細胞染色強度和陽性細胞計數進行半定量分析。染色強度評分標準:不著色為0分,黃色為1分,棕黃色為2分,黃褐色為3分。每張切片隨機觀察5個視野,計數500個細胞中陽性細胞所占比例進行評分,評分標準:陽性細胞<10%者為0分,10%～40%者為1分,40%～70%者為2分,≥70%者為3分。兩項評分相加,0～1分為(-),2分為(+),3～4分為(++),5～6分為(+++);其中(-)為陰性,(+～+++)為陽性。1.4計數資料比較及相關分析采用SPSS16.0統計軟件包進行統計分析。計數資料比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法;相關分析采用Spearman秩相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1正常乳房組織、慢性宮頸炎組織和cin組織的表達差異Survivin陽性細胞定位于細胞質內(圖1);Fas和FasL主要定位于細胞質和細胞膜(圖2、3)。不同宮頸組織中Survivin、Fas和FasL的表達見表1。Survivin和FasL在宮頸癌組織中的陽性表達率高于正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織和CIN組織,差異均有統計學意義(P<0.05);且兩者在正常宮頸組織中均不表達。Survivin在CIN組織中的陽性表達率與慢性宮頸炎組織相比差異無統計學意義(P>0.05),與正常宮頸組織比較差異有統計學意義(P<0.05);但Survivin在慢性宮頸炎組織和正常宮頸組織中的陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。FasL在CIN組織與慢性宮頸炎組織的陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05),但均明顯高于正常宮頸組織(P<0.05)。Fas在宮頸癌組織中陽性表達率均低于正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織和CIN組織(P<0.05);但正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織和CIN組織間的陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。2.2asl陽性表達率及與fas表達的關系采用Fisher精確概率法分析47例宮頸癌患者Survivin、Fas和FasL的表達(表2)。其中,在<35歲患者與≥35歲患者間,Survivin、Fas和FasL陽性表達率的差異無統計學意義(P>0.05)。Survivin的表達與宮頸癌臨床分期、是否有淋巴結轉移有關(P=0.043,P=0.008),與病理分級、組織類型、腫瘤生長類型無明顯關系(P>0.05)。Fas的表達與宮頸癌臨床分期、病理分級、組織類型、腫瘤生長類型、是否有淋巴結轉移均無明顯關系(P>0.05)。FasL的表達與宮頸癌臨床分期、病理分級、是否有淋巴結轉移有關(P=0.034,P=0.049,P=0.042),但與組織類型和腫瘤生長類型無明顯關系(P>0.05)。2.2fas表達在Survivin表達陽性的32例宮頸癌組織中,10例Fas表達陽性,32例FasL表達陽性;在Survivin表達陰性的15例宮頸癌組織中,13例Fas表達陽性,12例FasL表達陽性;Survivin與Fas的表達呈負相關(r=-0.517,P<0.01),與FasL的表達呈正相關(r=0.381,P<0.01)。在FasL表達陽性的44例宮頸癌組織中,21例Fas表達陽性;在FasL表達陰性的3例宮頸癌組織中,2例Fas表達陽性;FasL與Fas的表達相關性不顯著(r=-0.093,P>0.05)。3不同病理組織學檢測faol表達在正常提高和fas陽性表達率中的作用Survivin是IAP家族中最小的成員,它由定位在人染色體17q25位點的單拷貝基因編碼,是含有142個氨基酸、相對分子質量為16500的蛋白,具有抑制凋亡和調節細胞分裂的作用。Survivin在大多數終末分化組織中缺失或低表達,而在大多數人實質性腫瘤和血液惡性腫瘤中強表達,與腫瘤的發病、侵潤及預后密切相關。本研究結果提示Survivin表達與宮頸癌臨床分期和淋巴結轉移有關,與上述結論一致,提示Survivin作為一個腫瘤特異性因子,在宮頸癌預測患病危險度中有應用價值。Survivin主要通過以下兩種途徑抑制凋亡:第一,Survivin可通過細胞周期依賴激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)調節凋亡,通過促進CDK4釋放p21而抑制凋亡;第二,Survivin可與激活的Caspase3和Caspase7結合,阻止由Caspase激活劑或凋亡誘導劑誘導的細胞DEVD-cleaving自殺酶的累積;而Caspase3是Fas介導的細胞凋亡的重要通路,Survivin/CDK4復合物形成后引起p21釋放,并與線粒體內的Caspase3相互作用而抑制由Fas介導的細胞凋亡。然而有報道顯示,Survivin抑制激活Caspase9,并不抑制激活的Caspase3和Caspase7,這可能可以解釋本實驗中為何Survivin與Fas的結果并不一致。Fas是一種由定位于人染色體10q23的Fas基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白,相對分子質量為45000,在細胞凋亡中起調節作用。FasL是腫瘤壞死因子家族的一種Ⅱ型跨膜蛋白,定位在人染色體1q23,相對分子質量為40000,它與其受體結合介導凋亡。FasL/受體的相互作用在免疫系統調節和腫瘤進展中起到重要作用。近年來研究發現,許多腫瘤細胞通過其表面Fas和FasL,不但能有效逃避機體淋巴細胞的攻擊,而且還能主動殺死與之接觸的免疫活性細胞,導致免疫治療失敗。本研究發現,FasL在正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織、CIN組織和宮頸癌組織中呈現的表達逐級升高且差異有統計學意義,尤其是在慢性宮頸炎細胞中的表達相比正常細胞升高,提示FasL能有效促進細胞逃避淋巴細胞的攻擊,足以解釋經久未愈的慢性宮頸炎患者容易罹患CIN和宮頸癌的臨床現象,驗證了慢性炎癥在宮頸癌發生和發展中的作用。目前公認宮頸癌的發生、發展是由宮頸不典型增生(輕→中→重)→原位癌→早期浸潤癌→浸潤癌的連續發展過程,因此與國內其他研究不同的是本研究比較了Survivin、Fas、FasL在正常組織、慢性宮頸炎組織、CIN組織和宮頸癌組織中的表達差異,按宮頸癌發生、發展的連續過程比較3個指標的表達差異。本研究發現,Fas在宮頸癌陽性表達率遠低于正常宮頸組織,提示在宮頸癌的發生中可能存在Fas抗原缺失,這可能是宮頸癌發病機制之一。宮頸癌組織中FasL表達陽性率與宮頸癌的臨床分期、病理分級、淋巴結轉移有關,提示宮頸癌組織中FasL表達陽性率的高低可以反映病變惡性程度及病程進展。本研究結果還顯示,FasL在宮頸癌及在CIN中的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織,提示宮頸癌的發生與FasL表達上調有關;表明腫瘤細胞表達FasL,并可以通過促進體內Fas陽性的淋巴細胞凋亡逃避機體的免疫監視。FasL在慢性宮頸炎、宮頸CIN、宮頸癌組織中陽性表達率逐步升高以及在宮頸CIN組織中的高表達提示,FasL的影響出現于病變進程的早期,當FasL表達不能下調時通過抑制宿主的免疫系統,CIN將發展為浸潤癌,與目前公認的宮頸癌發生、發展的連續過程一致且密切相關。本研究還發現,FasL表達與宮頸癌的臨床分期、病理分級有關,有淋巴結轉移者FasL陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移者,提示FasL高表達者預后較差;更為重要的是FasL還與病變進程密切相關,而Survivin表達僅與臨床分期和淋巴結轉移有關,提示FasL可作為宮頸癌患者病程進展和預后的預測指標之一。Fas/FasL系統的生理功能在于通過對細胞凋亡的調節,限制某些細胞群落的過度膨脹或萎縮,參與正常細胞增殖、分化和凋亡動態平衡的維持,在臨床多種疾病的發生過程中具有重要的作用。Fas作為一種普遍表達的受體分子,可出現于多種細胞表面;但FasL的表達卻有其特點,通常只出現于活化的T細胞和NK細胞,因而已被活化的殺傷性免疫細胞往往能夠最有效地以凋亡途徑殺死靶細胞。研究發現,大多數良性腫瘤Fas的表達類似于其來源的正常組織,而惡性腫瘤的Fas表達明顯下調或缺失,逃避體內Fas/FasL系統對其的清除作用。本研究對上述3個指標的相關性分析發現,Survivin與Fas/FasL系統的表達有相關性,這與上述Survivin抵制凋亡的機