乳酸菌口服疫苗安全性評(píng)價(jià)

蘑菇是一種含有大量碳和酸的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌。它是人類和許多動(dòng)物腸道中的常見(jiàn)細(xì)菌。在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域，其應(yīng)用價(jià)值很高，被公認(rèn)為安全等級(jí)（gras，一般反應(yīng)）微生物。和益生作用有關(guān)的如乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬和雙歧菌屬等乳酸菌尤其受到人們的重視,利用一些乳酸菌在胃腸道、泌尿、生殖系統(tǒng)中或粘膜部位粘附存活且無(wú)病原性等特點(diǎn),開(kāi)展活菌口服疫苗研究,受到了廣泛的重視。口服疫苗通過(guò)胃腸粘膜進(jìn)行抗原遞呈,可經(jīng)不同的免疫通路,產(chǎn)生與常規(guī)注射類似的免疫反應(yīng)。隨著醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,口服疫苗在粘膜抗原遞呈方面的研究取得了很大的進(jìn)步,能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和免疫耐受。1分黏膜表面區(qū)域接觸疫苗口服疫苗與其他途徑相比,有一系列的優(yōu)點(diǎn)。口服疫苗可直接口服,無(wú)須靜脈注射給藥,避免了由于靜脈注射而導(dǎo)致感染的危險(xiǎn);模仿自然感染途徑,能夠保證大部分黏膜表面區(qū)域接觸疫苗,開(kāi)發(fā)了由sIgA介導(dǎo)的第一道防線;高效,即能引起黏膜免疫反應(yīng),也能引起系統(tǒng)免疫反應(yīng);口服疫苗也能誘導(dǎo)全身耐受性,抵抗特異T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性炎癥反應(yīng)。另外,對(duì)一些病原體進(jìn)行口服免疫可產(chǎn)生群體免疫,即一小部分個(gè)體獲得免疫后,免疫可在群體中傳播。口服免疫每天產(chǎn)生的抗體超過(guò)60%分泌到胃腸道,使許多細(xì)菌、病毒和病原體很難經(jīng)由身體粘膜表面進(jìn)入身體組織中。口服免疫經(jīng)常會(huì)同時(shí)引起局部或系統(tǒng)免疫反應(yīng),可以有效地消除病原體。2遺傳教育工作的特點(diǎn)近年來(lái),對(duì)疫苗傳遞系統(tǒng)的研究過(guò)程中,人們期待找到一種能夠在體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間存在,而對(duì)機(jī)體本身既安全又能產(chǎn)生持續(xù)免疫力的傳遞載體。作為一種原核表達(dá)系統(tǒng),乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源基因上有以下特點(diǎn):(1)某些菌種本身帶有大量的染色體外因子,易于發(fā)展新的表達(dá)載體系統(tǒng);(2)易培養(yǎng),遺傳操作方法成熟、簡(jiǎn)便,且效率高,重復(fù)性好;(3)本身為食品級(jí)細(xì)菌,易于構(gòu)建成食品級(jí)的基因克隆及表達(dá)系統(tǒng),可以有效提高基因工程產(chǎn)品的安全性;(4)本底表達(dá)水平低,表達(dá)量較高,易于純化;(5)具有強(qiáng)烈的高度可調(diào)控的啟動(dòng)子系統(tǒng),可表達(dá)毒素基因;(6)可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),也可在細(xì)胞表面進(jìn)行展示表達(dá)或分泌到細(xì)胞外;(7)乳酸菌安全、沒(méi)有內(nèi)毒素,表達(dá)的外源蛋白無(wú)需經(jīng)過(guò)純化,可以直接連同菌體一起服用;(8)乳酸菌的某些菌株如乳桿菌對(duì)機(jī)體粘膜有極強(qiáng)的粘附作用,乳酸菌表達(dá)與治療或免疫作用的蛋白可以源源不斷在粘膜處生產(chǎn),持續(xù)向機(jī)體釋放目的抗原蛋白,能有效引起機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫耐受,提高對(duì)人、畜的免疫作用,是一種極具廣泛應(yīng)用前景的、理想的抗原呈遞載體。3重組菌活性成分的檢測(cè)近年來(lái),對(duì)乳酸菌遺傳學(xué)方面的研究取得了顯著的進(jìn)展,導(dǎo)致了一系列關(guān)于乳酸菌的基因工程技術(shù)、轉(zhuǎn)化流程、載體系統(tǒng)、整合及擴(kuò)增系統(tǒng)的快速進(jìn)展,并已作為一種新的表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了多種外源基因。陳思維等為實(shí)現(xiàn)人胰島素基因在乳酸菌中的表達(dá),探索其用作口服疫苗治療Ⅰ型糖尿病(T1DM)的可行性。將人胰島素基因克隆至乳酸菌表達(dá)載體中,利用電激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到干酪乳桿菌中進(jìn)行表達(dá)。用含有表達(dá)重組人胰島素的菌體飼喂非肥胖糖尿病小鼠,發(fā)現(xiàn)可刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體,同時(shí)使與免疫耐受相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4水平明顯升高,揭示了其對(duì)非肥胖糖尿病小鼠產(chǎn)生免疫耐受有一定的作用,為研制乳酸菌口服疫苗防治Ⅰ型糖尿病的可行性進(jìn)行了有益的探索。楊光等用乳酸菌表達(dá)的白細(xì)胞介素IL-12用于哮喘小鼠,試驗(yàn)結(jié)果表明,攜帶IL-12基因乳酸菌鼻腔滴注能引起代表Th1反應(yīng)的IFN-γ升高,以及代表Th2反應(yīng)的IL-4降低,使BALF中EOS數(shù)減少。乳酸菌是一種良好的疫苗活載體,將治療性蛋白或抗原傳遞至黏膜表面,同時(shí)誘導(dǎo)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫。細(xì)胞表面展示表達(dá)技術(shù)的出現(xiàn)更是將乳酸乳球菌疫苗的研制提升到一個(gè)新的高度。第一個(gè)成功的例子是Ribeiro將流產(chǎn)布魯氏菌的抗原核糖體蛋白L7/L12,通過(guò)釀膿鏈球菌M6蛋白錨表達(dá)于乳酸乳球菌細(xì)胞表面,做成口服活疫苗治療布魯氏菌病,開(kāi)創(chuàng)了治療布魯氏菌病的疫苗策略的新方法。谷貴章等采用金黃色葡萄球菌蛋白A錨定域成功地構(gòu)建了一個(gè)將抗原靶向在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)系統(tǒng),為國(guó)內(nèi)口服活菌疫苗的研究提供了可行性操作平臺(tái)。國(guó)外用破傷風(fēng)毒素C片段(TTFC)作模型抗原已獲得許多乳酸菌用于免疫接種的知識(shí),開(kāi)辟了乳酸桿菌作為活疫苗的真實(shí)前景。預(yù)防嚴(yán)重的急性呼吸道綜合癥(SARS)病毒感染,誘導(dǎo)黏膜免疫可能是十分重要的。為了安全有效的將病毒抗原傳遞到黏膜免疫系統(tǒng),Lee等將SARS-CoVS基因與表達(dá)載體連接,通過(guò)多聚谷氨酸合成酶A蛋白(pgsA)錨定到干酪乳酸桿菌細(xì)胞表面進(jìn)行展示表達(dá),間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)表明重組菌表達(dá)蛋白定位于菌體表面。將重組菌口服和滴鼻免疫小鼠后,不同時(shí)間采集小鼠血液樣本,測(cè)定其血清中抗SARS的特異性IgG抗體水平,結(jié)果表明重組菌能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng),口服和滴鼻免疫沒(méi)有明顯的差異。分別在70d和84d收集腸液和肺液,間接ELISA檢測(cè)粘膜IgA抗體水平,結(jié)果表明無(wú)論是在小腸粘液中還是在肺泡液中均可檢測(cè)到大量的抗體。更重要的是,這些抗體可以中和嚴(yán)重的急性呼吸道綜合癥(SARS)假病毒粒子,經(jīng)口免疫的中和抗體反應(yīng)大于經(jīng)鼻免疫。上述結(jié)果顯示,重組SARS病毒S蛋白干酪乳酸桿菌能夠激發(fā)抗病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。Hou等將豬流行性腹瀉炎病毒(PEDV)N基因與表達(dá)載體連接,通過(guò)多聚谷氨酸合成酶A蛋白(pgsA)錨定到乳酸桿菌細(xì)胞表面進(jìn)行展示表達(dá),并將重組菌口服和滴鼻免疫小鼠后,不同時(shí)間采集小鼠血液樣本,測(cè)定其血清中抗PEDV的特異性IgG抗體水平。結(jié)果表明重組菌能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng),口服和滴鼻免疫沒(méi)有明顯的差異。分別在70d和84d收集腸液和肺液,間接ELISA檢測(cè)粘膜IgA抗體水平,結(jié)果表明無(wú)論是在小腸粘液中還是在肺泡液中均可檢測(cè)到大量的抗體。更重要的是,這些抗體可以中和豬流行性腹瀉炎病毒。上述結(jié)果顯示,重組PEDV-N蛋白干酪乳酸桿菌能夠激發(fā)抗病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科研究所姚曉英等用表達(dá)hCGβ的活重組乳酸桿菌經(jīng)陰道黏膜途徑免疫不同品系小鼠,產(chǎn)生抗hCGβ免疫應(yīng)答。取不同劑量的重組乳酸桿菌LbhCGβ經(jīng)陰道黏膜首免6~8周齡雌性BALB/c和C257BL/6小鼠,3周后以相同劑量加強(qiáng)免疫一次。間接ELISA檢測(cè)初次免疫后2~8周血清和陰道灌洗液中抗hCGβIgG和IgA抗體滴度。分離免疫小鼠脾、子宮和陰道黏膜的淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析其中B和T細(xì)胞的增殖情況,ELISPOT分析分泌抗hCGβIgG和IgA抗體的細(xì)胞克隆數(shù)。結(jié)果表明,高劑量接種LbhCGβ可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答;加強(qiáng)免疫后,高劑量組LbhCGβ誘導(dǎo)的抗血清中和hCGβ抗原的能力大于100ng/ml。LbhCGβ陰道黏膜免疫后T和B細(xì)胞增殖;脾臟、子宮及陰道內(nèi)均存在抗hCGβIgG及IgA抗體分泌細(xì)胞。因此,重組乳酸桿菌活疫苗LbhCGβ可經(jīng)陰道黏膜免疫誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生的應(yīng)答與免疫劑量呈正相關(guān)。唐麗杰等將豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S基因與分泌型表達(dá)載體連接,并轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá),間接免疫熒光試驗(yàn)表明重組菌表達(dá)蛋白定位于菌體表面。將表達(dá)TGEV-S基因的乳酸乳球菌口服免疫小鼠后,不同時(shí)間測(cè)定腸道糞便中抗體sIgA的結(jié)果表明,重組乳酸乳球菌可有效的刺激小鼠腸道免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng),且黏膜免疫水平效果明顯。初步證明了以乳酸乳球菌作為口服疫苗的可行性。重組菌口服接種小鼠后未見(jiàn)有在增重和食欲等方面的不良影響,說(shuō)明重組菌對(duì)動(dòng)物是安全的。徐義剛等將構(gòu)建的細(xì)胞表面表達(dá)和分泌表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組干酪乳桿菌口服免疫BALB/c小鼠。免疫后不同時(shí)間收集免疫小鼠糞便及腸黏液樣本測(cè)定小鼠產(chǎn)生抗PPV的特異性sIgA抗體水平,采集小鼠血液樣本測(cè)定其血清中抗PPV的特異性IgG抗體水平。結(jié)果表明,2種表達(dá)系統(tǒng)均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答,分泌型的重組菌系統(tǒng)免疫小鼠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗PPV的特異性sIgA和IgG抗體水平高于細(xì)胞表面表達(dá)型的重組菌系統(tǒng)的免疫效果,表明分泌型的重組乳酸菌作為活菌疫苗具有更好的免疫原性。4益生菌疫苗的最佳工藝首先,乳酸菌作為口服疫苗載體雖然具有很多優(yōu)點(diǎn),但是在乳酸菌疫苗市場(chǎng)化之前仍面臨很多問(wèn)題。目前可用于構(gòu)建疫苗的載體菌株僅限于乳酸乳球菌和乳酸桿菌屬中的幾個(gè)菌株,表達(dá)的抗原蛋白僅限于幾種,構(gòu)建成功的疫苗也不多,開(kāi)發(fā)更多、更有效的疫苗載體株,構(gòu)建更多、更有效的疫苗是今后的一個(gè)研究方向。第二,對(duì)目前構(gòu)建的疫苗