混合飼喂益生菌對(duì)仔豬腸道腸絨毛發(fā)育的影響

結(jié)腸是吸收養(yǎng)分的主要場(chǎng)所。腸道毛的生長(zhǎng)和發(fā)育直接影響著結(jié)腸的吸收效率。早期飼喂益生菌能夠促進(jìn)仔豬腸道正常微生物區(qū)系的建立,改善腸絨毛的存在環(huán)境,保護(hù)小腸絨毛的生長(zhǎng)和發(fā)育。枯草芽孢桿菌是廣泛存在于土壤和植物中的優(yōu)勢(shì)菌群,進(jìn)入動(dòng)物腸道后,能顯著降低腸道大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和沙門菌的數(shù)量,而且對(duì)小腸絨毛的發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用。乳酸桿菌在宿主體內(nèi)定植后,對(duì)腸道的發(fā)育也具有重要作用,能對(duì)病原菌等引起的腸黏膜細(xì)胞損傷進(jìn)行修復(fù)。從理論上講,枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌配合會(huì)更好地促進(jìn)小腸的發(fā)育,然而,當(dāng)前很少有關(guān)于這兩種益生菌在體內(nèi)具有協(xié)同作用、更好地促進(jìn)腸絨毛發(fā)育的研究。因此,本試驗(yàn)選用新生仔豬作為研究對(duì)象,通過飼喂枯草芽孢桿菌、豬源乳酸桿菌以及同時(shí)飼喂這兩種益生菌,研究枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌對(duì)新生仔豬腸絨毛發(fā)育的影響以及這兩種益生菌在體內(nèi)的抗感染能力,以期為益生菌在防治仔豬消化道疾病方面的合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1豬源培養(yǎng)基的篩選枯草芽孢桿菌RJGP16(BacillussubtilisRJGP16)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院高學(xué)文教授饋贈(zèng)。用LB培養(yǎng)基25℃振蕩培養(yǎng)24h,用分光光度計(jì)測(cè)其濃度后3000×g離心,再用無菌PBS懸浮至1.0×109CFU·mL-1。豬源唾液乳酸桿菌B1(LactobacillussalivariusB1)由本試驗(yàn)室從健康斷奶仔豬十二指腸黏膜分離并鑒定。挑選產(chǎn)酸能力強(qiáng)及黏附性好的菌株,37℃無氧條件下,MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,用分光光度計(jì)測(cè)其濃度后3000×g離心,再用無菌的PBS懸浮至1.0×109CFU·mL-1。腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌K88(EnterotoxigenicE.coilK88)分離自仔豬腸道食糜,并由本實(shí)驗(yàn)室保存。將K88接種于LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)10h,3000×g離心10min,收集菌體,用DMEM培養(yǎng)液重懸菌體至1.0×108CFU·mL-1。1.2試驗(yàn)分組和給藥本試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合養(yǎng)殖基地進(jìn)行,選取母豬體況相似、胎次接近(均為第3~4胎次)、預(yù)產(chǎn)期接近(相差1~3d)的8窩新出生的蘇鐘豬(長(zhǎng)白豬×太湖豬,每窩9~15頭),隨機(jī)分成3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組2窩(每窩隨機(jī)選取8頭)。試驗(yàn)組分為3個(gè)處理組,分別于0、7、14和26日齡經(jīng)口腔灌服枯草芽孢桿菌菌液(活菌數(shù)1.0×109CFU·mL-1)、豬源乳酸桿菌菌液(活菌數(shù)1.0×109CFU·mL-1)、枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌混合菌液(體積比1∶1)1、2、3、5mL·頭-1。對(duì)照組灌服同體積生理鹽水。試驗(yàn)期內(nèi)小豬自由飲水,7日齡開始飼喂無抗無藥的教槽料。仔豬飼養(yǎng)至28日齡,每組隨機(jī)取3頭靜脈放血處死,采集腸道組織樣品包括十二指腸(距離幽門末端10cm)、空腸(距離幽門末端35cm)和回腸(距離回盲交界10cm)各1.5cm。所有組織樣品在Bouin’s液中固定24h后,常規(guī)脫水、透明、浸蠟,石蠟包埋。對(duì)照組和同時(shí)飼喂2種益生菌的試驗(yàn)組繼續(xù)飼喂,從每組中隨機(jī)挑選5頭仔豬進(jìn)行隔離飼喂,分別于32、34和36日齡灌服腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌K882mL·頭-1(1.0×108CFU·mL-1),并記錄疾病的發(fā)生情況。38日齡時(shí)隨挑選攻毒和未攻毒仔豬各3頭,頸靜脈放血處死,取十二指腸、空腸和回腸各1.5cm,Bouin’s液固定24h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟,石蠟包埋。1.3組織切片觀察石蠟切片(5μm)放入二甲苯2×10min;梯度酒精脫二甲苯;常規(guī)H/E染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片。Olympus顯微鏡觀察、拍照。用OlympusBH-2顯微鏡觀察組織切片并拍照。每頭豬隨機(jī)選取3張H/E切片,在低倍鏡下觀測(cè)切片,選擇典型視野,在高倍鏡下觀測(cè)視野中完整絨毛,記錄絨毛數(shù)量;每張切片選10根腸絨毛和方向筆直的隱窩,用來測(cè)量腸絨毛長(zhǎng)度、寬度和隱窩深度。平均值用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0分析軟件(Chicago,IL)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn):P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著。2結(jié)果2.1腸黏膜組織病理學(xué)表現(xiàn)由組織學(xué)照片(圖1~4)可以看出:對(duì)照組的仔豬,其十二指腸(圖2)、空腸(圖3)、回腸(圖4)的腸上皮細(xì)胞排列整齊。飼喂K88的仔豬,其十二指腸(圖2)、空腸(圖3)和回腸(圖4)的腸黏膜組織結(jié)構(gòu)大致完整,但有較明顯的病理變化,主要表現(xiàn)為充血和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),腸上皮變薄,固有膜內(nèi)細(xì)胞凌亂,并且有些細(xì)胞變性和壞死。主要以回腸最為嚴(yán)重,其次為空腸。病變程度與癥狀嚴(yán)重程度相關(guān),較輕者只發(fā)生黏膜層或黏膜下層局部水腫,輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(主要為淋巴細(xì)胞),病變呈局灶性。嚴(yán)重者水腫范圍廣泛,黏膜內(nèi)、黏膜下層及肌層都有水腫發(fā)生,而且充血明顯,個(gè)別甚至有出血。飼喂枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌后,再接種K88,對(duì)十二指腸、空腸、回腸的腸絨毛上皮細(xì)胞幾乎沒有影響。2.2各組大鼠腸道絨毛長(zhǎng)度的比較從圖5的統(tǒng)計(jì)可以看出,單獨(dú)飼喂豬源乳酸桿菌或同時(shí)飼喂枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌都能顯著增加十二指腸絨毛的長(zhǎng)度(P<0.05),同時(shí),3個(gè)試驗(yàn)組回腸的絨毛長(zhǎng)度均顯著增加(P<0.01),而各試驗(yàn)組中,空腸絨毛長(zhǎng)度均無明顯變化(P>0.05)。2.3rjp16和豬源乳酸桿菌b1對(duì)仔豬腸道各部分腸毛的影響與對(duì)照組相比,單獨(dú)飼喂枯草芽孢桿菌、豬源乳酸桿菌或同時(shí)飼喂這兩種益生菌對(duì)小腸各段絨毛寬度(圖6)均無明顯影響(P>0.05)。2.4枯草芽孢桿菌對(duì)小鼠毛數(shù)量的影響與對(duì)照組相比,單獨(dú)飼喂豬源乳酸桿菌能顯著增加小腸3個(gè)腸段的絨毛數(shù)量(P<0.01);而單獨(dú)飼喂枯草芽孢桿菌對(duì)3個(gè)腸段絨毛數(shù)量均沒有顯著影響;在同時(shí)飼喂這兩種益生菌后,十二指腸(P<0.05)和空腸(P<0.01)絨毛的數(shù)量有顯著增加(圖7)。2.5單獨(dú)飼料豬源乳酸桿菌對(duì)空腸和回腸毛隱窩的影響與對(duì)照組相比,單獨(dú)飼喂枯草芽孢桿菌或同時(shí)飼喂枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌都能顯著降低空腸(P<0.05)和回腸(P<0.01)絨毛隱窩的深度(圖8),單獨(dú)飼喂豬源乳酸桿菌也能顯著降低空腸絨毛隱窩的深度(P<0.05);而各試驗(yàn)組中,十二指腸絨毛隱窩的深度均無明顯變化(P>0.05)。2.6豬源乳酸桿菌對(duì)克氏原螯蝦絨腺比的影響與對(duì)照組相比,單獨(dú)飼喂枯草芽孢桿菌能顯著增加空腸和回腸的絨腺比(P<0.01),單獨(dú)飼喂豬源乳酸桿菌對(duì)十二指腸、空腸和回腸的絨腺比均有明顯的升高作用(P<0.01),而同時(shí)飼喂這兩種益生菌也都能顯著增加十二指腸(P<0.05)、空腸(P<0.05)和回腸(P<0.01)的絨腺比(圖9)。3討論3.1不同益生菌對(duì)腸絨毛和腸絨肉的影響小腸絨毛可以極大地增加小腸內(nèi)壁表面積,提高小腸的吸收效率。絨毛之間存在的隱窩是絨毛新細(xì)胞的來源。當(dāng)絨毛脫落時(shí),隱窩細(xì)胞向絨毛頂移行,形成新絨毛。腸上皮的正常結(jié)構(gòu)不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被充分消化吸收的基本保證,也是發(fā)揮屏障功能和黏膜免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。腸絨毛生長(zhǎng)依賴腸腺中的柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的增殖、分化及移行,小腸絨毛的生長(zhǎng)狀況與仔豬的營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)關(guān)系極為密切。隱窩深度反映細(xì)胞的生成率,隱窩變淺表明細(xì)胞成熟率上升,分泌功能增強(qiáng)。絨毛高度/隱窩深度(絨腺比)綜合反映小腸的功能狀態(tài)。4日齡仔豬口服產(chǎn)酸菌后可以促進(jìn)腸絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果表明,單獨(dú)飼喂枯草芽孢桿菌、豬源乳酸桿菌或同時(shí)飼喂這兩種益生菌,對(duì)腸道形態(tài)的影響主要體現(xiàn)在增加十二指腸和回腸絨毛的長(zhǎng)度,同時(shí)增加十二指腸和空腸絨毛數(shù)量,以及降低空腸和回腸隱窩的深度,而對(duì)腸絨毛寬度沒有明顯的作用。小腸絨毛一些增殖的改變僅可通過總長(zhǎng)度與隱窩深度比例(絨腺比)才能反映出來,據(jù)研究報(bào)道,小腸絨腺比在2~3之間是比較適宜的。從本試驗(yàn)可以看出,單獨(dú)飼喂豬源乳酸桿菌或同時(shí)飼喂枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌都能使十二指腸、空腸和回腸的絨腺比提升至適宜范圍,而單獨(dú)飼喂枯草芽孢桿菌僅能使空腸和回腸的絨腺比提升至適宜范圍,這可能是由于所用的乳酸桿菌是分離自豬體,外源性的枯草芽孢桿菌對(duì)腸道的刺激作用不及內(nèi)源菌,其具體的作用效果還有待進(jìn)一步的研究。該試驗(yàn)結(jié)果也說明了筆者所選用的2種益生菌在仔豬體內(nèi)對(duì)腸絨毛的發(fā)育產(chǎn)生了一定的協(xié)同刺激作用。3.2枯草芽孢桿菌對(duì)新生東南角的影響腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)屬于非胞內(nèi)侵襲性細(xì)菌,其致病性取決于它在宿主小腸上皮細(xì)胞上的定植能力和產(chǎn)腸毒素能力。ETEC進(jìn)入腸道后,借助黏附素性菌毛與小腸上皮細(xì)胞絨毛邊緣的特異性受體結(jié)合,繁殖并分泌毒素,毒素進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致水鈉代謝混亂,最終引起腹瀉。有報(bào)道表明,用ETEC感染豚鼠后,通過組織學(xué)的方法可觀察到空腸和回腸組織的病變,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),甚至有出血現(xiàn)象,其小腸上皮絨毛變短,空泡樣變性,線粒體腫脹變性。這說明ETEC的致病機(jī)制并不局限于影響小腸細(xì)胞對(duì)水和電解質(zhì)的分泌和吸收功能。近年來,枯草芽孢桿菌能拮抗人和動(dòng)物病原菌的報(bào)道越來越多,例如:枯草芽孢桿菌可拮抗鼠類檸檬酸桿菌及人鼠共患的腸出血性和腸致病性大腸埃希氏菌;在禽類,枯草芽孢桿菌飼喂SPF雞后,可抑制禽大腸埃希菌、腸炎沙門菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的繁殖。乳酸桿菌在預(yù)防由大腸埃希菌所導(dǎo)致的腸道疾病方面也發(fā)揮了很重要的作用,其通過抑制病原菌在腸黏膜表面的黏附,以及抑制腸道病原菌對(duì)單層細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白的破壞,維持腸道上皮細(xì)胞的完整性;或是調(diào)節(jié)炎性因子的分泌,從而緩解腸道黏膜的機(jī)能障礙,降低因大腸埃希氏菌感染而出現(xiàn)的腹瀉的發(fā)生率。本試驗(yàn)中,進(jìn)行K88攻毒試驗(yàn)后,對(duì)照組的5頭仔豬均先后出現(xiàn)不同程度的腹瀉,表現(xiàn)為排便次數(shù)增多,糞便外觀從“非常軟并含有少量水樣糞”到“完全水樣糞”不等;而先給新生仔豬同時(shí)飼喂枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌再進(jìn)行攻毒的試驗(yàn)組中,只有2頭仔豬的糞便外觀呈“非常軟并含有少量水樣糞”,并且38日齡時(shí)已接近完全恢復(fù)。同時(shí),通過組織學(xué)的方法可觀察到,同時(shí)給予2種益生菌后再攻毒的仔豬,其腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,沒有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),這就表明枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌在仔豬體內(nèi)對(duì)ETECK88能起到抑制作用,能