第一節(jié)微生物的分離和培養(yǎng)2023最新整理收集do

something微生物的類群微生物：一般指形體微小(小于0.1mm)，結(jié)構(gòu)簡單，在適宜環(huán)境中能迅速生長繁殖，通常要借助顯微鏡才能看清楚的生物。大約有10萬種。微生物原核生物原生生物真菌病毒細菌、放線菌、藍藻、支原體酵母菌、霉菌、大型真菌草履蟲、變形蟲、衣藻噬菌體、艾滋病毒真菌酵母菌霉菌大型真菌細菌螺旋菌球菌桿菌芽孢

有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當環(huán)境（如溫度、水分）適宜的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌。一、微生物的培養(yǎng)基1、概念：培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是為人工培養(yǎng)微生物而制備的適合微生物生長、繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。

（1）按成分分：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基。2、培養(yǎng)基的類型（2）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。區(qū)別：加入凝固劑的量，常用的凝固劑是：瓊脂

單個或者少數(shù)微生物在固體培養(yǎng)基表面生長繁殖,可以形成肉眼可見子細胞的群體——菌落固體培養(yǎng)基：用于微生物分離、鑒定、計數(shù)細菌的菌落特征因種而異。菌落特征是微生物鑒定的重要依據(jù)。液體培養(yǎng)基：工業(yè)生產(chǎn)表面生長均勻混濁生長沉淀生長半固體培養(yǎng)基：觀察微生物的運動無動力有動力(彌散)(是否運動)

（3）按功能分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、

選擇培養(yǎng)基

鑒別培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有微生物生長所需的基本物質(zhì)。選擇培養(yǎng)基：培養(yǎng)基加入某種物質(zhì)或缺少某種營養(yǎng)物質(zhì)而抑制不需要的微生物生長促進需要的微生物生長。鑒別培養(yǎng)基：鑒別不同種類的微生物伊紅—美藍培養(yǎng)基大腸桿菌菌落呈深紫色、有金屬光澤幾種選擇培養(yǎng)基：加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都包括哪些成分？答：不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì),有時還要加入維生素等特殊的營養(yǎng)物質(zhì)。

注：另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、pH、滲透壓等的要求。

1、碳源概念：凡能為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)無機碳源：CO2、NaHCO3等(自養(yǎng)微生物）有機碳源：糖類、脂肪酸、花生餅粉、石油等

（異養(yǎng)微生物）1、主要用于構(gòu)成微生物的細胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物2、異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì)來源作用單質(zhì)碳不能作為碳源能否利用無機碳源區(qū)分自養(yǎng)與異養(yǎng)微生物有機碳源即是碳源又是能源2、氮源作用：來源概念：凡能為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)無機氮源：N2、氨、銨鹽、硝酸鹽等有機氮源：尿素、蛋白質(zhì)、氨基酸等主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物關(guān)于氮源物質(zhì)的來源和作用1、對許多微生物來說，既可利用無機含氮化合物作為氮源，也可利用有機含氮化合物作為氮源；2、固氮微生物可以利用氮氣作為氮源進行生長；3、銨鹽、硝酸鹽等既可作為微生物最常用的氮源，也可作為某些化能自養(yǎng)微生物的能源物質(zhì)；4、自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物類型的劃分主要是依靠能否以CO2作為生長的主要或唯一碳源，而不決定于氮源。學(xué)案：T2、T3、T4、T5、T63、水

含量很高，不僅是良好的溶劑而且可維持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。4、無機鹽含義：為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素，包括大量元素和微量元素。主要作用：細胞內(nèi)的組成成分，生理調(diào)節(jié)物質(zhì)；某些化能自養(yǎng)菌的能源，酶的激活劑。5、特殊營養(yǎng)物質(zhì)：維生素、氨基酸、堿基等。生長必不可少的微量有機物。二、無菌技術(shù)1、無菌操作——微生物接種和培養(yǎng)的關(guān)鍵2、滅菌與消毒

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。⑴滅菌：是指采用強烈的物理或化學(xué)方法使物體內(nèi)外所有的微生物永遠喪失生長和繁殖的方法。1、灼燒滅菌:（接種工具）2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。（玻璃器皿）3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.（培養(yǎng)基）常用滅菌的方法：⑵消毒：是指用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺滅物體上絕大多數(shù)微生物的方法。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用70%

----75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……常用消毒的方法：1．無菌技術(shù)包括：（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行

滅菌

；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近

旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與

周圍物品

相接觸。2．消毒方法：（1）日常生活經(jīng)常用到的是

煮沸消毒法；（2）對一些不耐高溫的液體，則使用

巴氏

消毒法（作簡要介紹）；（3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用

紫外線進行物理消毒。（4）實驗操作者的雙手使用酒精進行消毒；（5）飲水水源用氯氣進行消毒。3．滅菌方法：（1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用

灼燒

滅菌法；（2）玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是

干熱滅菌箱；（3）培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用

紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。三、配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（P10）1、配制培養(yǎng)基計算、稱量、溶化

邊加熱邊用玻棒攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。2、調(diào)節(jié)pH3、分裝

培養(yǎng)基的高度約為試管長度的1/5。不要污染試管口，隨后立即用棉花塞緊試管口4、包扎3--5支試管扎成一捆，用牛皮紙將試管口包扎好。注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期等5、滅菌

121℃、100KPa、20min，滅菌完畢后切斷電源，待壓力表指針指向“0”點、溫度降至60℃以下后，取出滅菌物品。6、擱置斜面

冷卻至50℃左右；斜面長度不超過試管長度的1/2六、平板劃線分離和培養(yǎng)大腸桿菌1、平板制作（P13）⑴滅菌：培培養(yǎng)基、養(yǎng)皿等⑵倒平板：冷卻至50℃左右；酒精燈火焰旁；培養(yǎng)皿蓋打開稍大于錐形瓶口的縫隙；凝固后倒置。⑴培養(yǎng)基是否被雜菌污染的方法？⑵平板冷卻凝固后為什么要將平板倒置？⑶倒平板過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間，這個平板還適合培養(yǎng)微生物嗎？為什么？四、接種1、接種：在無菌條件下將微生物接入培養(yǎng)基的操作過程。2、接種工具和接種方法⑴接種針：穿刺接種⑵接種環(huán)：斜面接種或劃線接種⑶玻璃涂布器（刮鏟）：涂布平板接種五、斜面接種和培養(yǎng)大腸桿菌主要目的：菌種轉(zhuǎn)移、擴大培養(yǎng)和保存純凈菌種等。操作步驟：P11----P13討論：1、為什么在酒精燈火焰附近接種？2、如何將接種環(huán)進行滅菌處理？3、滅菌過的接種環(huán)為什么要冷卻后再挑取少許菌體？4、接種后對試管口與試管塞如何處理？目的是什么？六、平板劃線分離和培養(yǎng)大腸桿菌2、平板劃線法

是指用帶有微生物的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而達到純化分離微生物的一種方法。過程：P13-14將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞將試管口通過火焰.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。.將試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置注意：接種和劃線操作時需要在酒精燈火焰附近進行；挑取菌種之前、第二、三次劃線之前結(jié)束后都需要灼燒接種環(huán)；灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后才能挑取菌種或劃線；劃線用力大小要適合，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。

第一次灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中取少量稀釋液滴加到培養(yǎng)基表面待酒精燃盡后冷卻8～10s將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃灼燒用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻稀釋涂布平板法平板劃線法:稀釋涂布平板法:連續(xù)劃線,逐步稀釋(不能計數(shù))梯度稀釋，分別涂布（可計數(shù)）純化微生物的方法：統(tǒng)計菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目少，一個菌落有可能來源于2-3個或更多個個體

土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一、篩選菌株無機鹽碳源氮源凝固劑尿素是唯一氮源的選擇培養(yǎng)基二、統(tǒng)計菌落數(shù)目用什么方法統(tǒng)計？①稀釋涂布平板法②顯微鏡直接計數(shù)一般選擇菌落數(shù)在

的平板進行計數(shù)。統(tǒng)計菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目

。30-300低（酵母菌）血球板計數(shù)法2.計算公式每克樣品中的菌落數(shù)＝（C÷V）×M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL），M代表稀釋倍數(shù)。

稀釋涂布平板法統(tǒng)計菌落數(shù)目1.理論依據(jù)：

恰當?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準確，通常將幾個稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。三、設(shè)置對照目的：排除無關(guān)變量（非測試因素）的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。空白對照：培養(yǎng)基是否有雜菌污染四、實驗設(shè)計土壤取樣

制備培養(yǎng)基

樣品稀釋

涂布培養(yǎng)

觀察統(tǒng)計

1.取樣時，一般要鏟去表層土。

2.分別制備

的選擇性培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（判斷選擇培養(yǎng)基是篩選出分解尿素的細菌）

3.不同的微生物要采用不同的稀釋度。

4.每個稀釋度需倒6個平板：

4個選擇性培養(yǎng)基，3個涂布，1個空白；

2個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，一個涂布，一個空白。以尿素為唯一氮源

將待測樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.1mL接種到已制備好的平板上