解酒護肝片對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

肝臟是人體的五臟之一。它是動物身體中以代謝功能為主的器官，它在身體中扮演著去除氧化、儲存肝臟糖和合成蛋白質的角色。但是,近年來我國酒精性肝病亦有上升趨勢。酒精性肝病是由長期大量飲酒導致的肝臟疾病,初期通常表現為脂肪肝,進而可發展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化;嚴重酗酒時可以誘發廣泛的肝細胞壞死或急性肝功能衰減。因此,酒精性肝病的防治迫在眉睫。當前市場上解酒護肝的產品大都是以分解酒精濃度為主,而且部分產品中添加了利尿劑、興奮劑、激素等,這些物質服用后,短時間內會感到清醒、亢奮、食欲大開,但其副作用較大,長期服用將傷及身體;同時,其功效有限,僅能緩解酒精濃度夠高造成的頭暈、嘔吐等癥狀,對肝的保護作用不大。本研究采用中醫藥理論為基礎,充分利用藥食兩用中藥材中的靈芝、葛根、枳椇子、枸杞子為主要原料,在量的調配上令各味中藥之間的藥效相輔相成,相得益彰。因此,本研究旨在通過動物實驗,觀察預防性給予解酒護肝片對實驗性酒精性肝病的保護作用。1.材料和方法1.1實驗動物動物昆明種小鼠,雄性,體重20～24g,安徽醫科大學實驗動物中心提供,準字號:皖實動第03號。1.2釀酒集團有限公司本實驗所用中藥材購于東莞市國藥藥業連鎖有限公司;衡水老白干酒(河北衡水老白干釀酒(集團)有限公司);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒均購自南京建成生物制劑公司。1.3u3000儀器UV-265紫外分光光度計(日本島津);電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)202-3AB型;電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)DK-98-1A;真空旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)RE52-99;抽濾機(鄭州長城科工貿有限公司)SHB-B95型;離心沉淀機(上海醫用分析儀器廠)LXT-II;分析天平(德國賽多利斯)。1.4酒護肝片的制備1.4.1肝臟保護片的制備工藝圖1.4.2制備浸膏的方法A.提取:將靈芝、葛根、枳椇子、枸杞子,分別稱取相應的量后一起放入紗布袋中;再將裝有藥材的紗布袋置于提取罐中,加9～12倍藥材量的水在85℃提取2.5h,過濾,得提取液。重復一次,合并,得到提取液;B.提取、濃縮:濃縮、過濾:將上述提取液在真空條件下進行濃縮,當濃縮液密度在1.05～1.16時,過濾,得到濃縮浸膏;C.噴霧干燥:將步驟B中濃縮得到的浸膏進行噴霧干燥,制得成浸膏干粉;D.混合、過篩:將步驟C中所制得的浸膏干粉先過40～70目篩,然后加入磷酸氫鈣、淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉,經混合機混合均勻,制得原料輔料混合物;E.制粒、干燥:取步驟D制得的原料輔料混合物投入到高速混合制粒機中,先干混120～360秒,然后加10%淀粉漿,攪拌制粒50～150s,出粒,制得濕顆粒;將濕顆粒投入到高效沸騰干燥機中進行干燥,干燥溫度為35℃～65℃,干燥時間為1～3小時,取出干顆粒,冷卻至常溫;F.壓片:將步驟E中的顆粒與硬脂酸鎂于混合機中混合5～30分鐘,壓片,制得成品。1.5高、中、低劑量回血藥濃度設計參照李東良和何福金等造模方法并加以改進。小鼠50只,隨機分為5組,正常對照組、造模組、高、中、低劑量3個劑量組。實驗室適應性飼養7天后,衡水老白干酒灌胃0.5ml/只。高、中、低劑量給藥組分別給藥折合成生藥2.50、1.25和0.25g/(kg·d),灌胃;正常對照組和模型對照組等體積生理鹽水灌胃,1次/d,2.0ml/只,連續30d。1.6觀察指標1.6.1一般情況下觀察實驗過程中各組動物的一般情況,包括精神、活動、飲食、排便、皮毛、體重。1.6.2血清分離血動物禁食12h后,稱重,以7.0%水合氯醛5.0ml/kg腹腔注射麻醉小鼠,斷頭取血,靜止2h后,以3500r/min離心5min,分離血清,儲存備用。血清天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測按試劑盒的說明書操作進行。1.7數據處理和統計分析統計學處理應用SPSS13.0統計軟件進行分析,實驗數據用xˉ±sxˉ±s表示,多組間比較采用方差分析,各組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.01為有顯著性差異,P<0.05為有差異。2.結果2.1實驗大鼠實驗實驗過程中正常對照組大鼠精神狀態較好,體質量持續增加,無異常狀況。造模組大鼠實驗初期,均出現精神萎靡、食欲減退、嗜睡、小便黃、大便干等現象。而給予高劑量解酒護肝片后,該組的精神狀態和飲食、大便情況均較模型組好轉。2.2對血清ast、alt水平的影響模型組血清AST、ALT水平明顯高于正常組;而解酒護肝片干預處理后各組血清的AST、ALT水平較模型組均明顯降低(P<0.05),其中高劑量組的血清AST、ALT水平較低、中劑量組低(P<0.05),并且低于陽性對照組(P<0.05)。見表1。2.3對血清tg、mda水平的影響由表2可見,模型組的MDA、TG含量顯著高于空白對照組(p<0.01),說明乙醇對肝臟造成損傷。而解酒護肝片干預處理后各組血清的TG、MDA水平較模型組均明顯降低(P<0.05),其中高劑量組的血清TG、MDA水平較低、中劑量組低(P<0.05),并且低于陽性對照組(P<0.05),說明解酒護肝片的護肝效果比解毒降脂片的效果好。該結果表明灌胃本解酒護肝片對于小鼠的肝臟抵抗乙醇的脂質過氧化損傷有很好的輔助作用。2.4肝臟保護作用由表3可見,模型對照組的SOD、GSH含量顯著高于空白對照組(p<0.01),說明解酒護肝片對肝臟起到保護作用。并且解酒護肝片干預處理后各組血清的SOD、GSH水平較模型組均明顯升高(P<0.05),其中高劑量組的血清SOD、GSH水平最高、中劑量組較高(P<0.05),但都高于陽性對照組(P<0.05),說明灌胃本解酒護肝片對于小鼠的肝臟抵抗乙醇的脂質過氧化損傷有很好的輔助作用。3.解酒護肝片對肝損傷小鼠肝功能指標的影響中醫學認為酒性溫味辛,過量飲用傷及脾胃,臨床上患者主要表現為眩暈、脘腹脹滿、納呆、脅痛等癥。酒精進入機體后,約90%在肝臟內氧化,體內少量乙醇可在ADH和ALDH作用下代謝生成CO2和H2O排出體外。一次性大量或長期慢性攝入酒精,血中乙醇濃度過高,超過肝臟正常生理代謝的解毒能力,產生大量自由基。過量的自由基可引起肝細胞膜發生脂質過氧化反應,使細胞膜和細胞器結構破壞,膜流動性失常,大量肝內酶(AST、ALT)釋放入血,并可使清除自由基酶(如SOD)耗竭,肝細胞損傷進一步加重,肝功能異常,脂肪代謝紊亂,肝組織細胞脂肪樣和空泡樣變性,最終導致肝細胞廣泛壞死,細胞腫脹死亡,從而引起酒精性肝病。本實驗中,小鼠經酒精損傷后肝功能指標(ALT、AST)明顯升高,同時出現不同程度的病理改變,而本解酒護肝片可以降低肝損傷小鼠血清中AST、ALT,增強肝臟中SOD和GSP活性,降低MDA、TG含量。說明本研究中所復制的模型是成功的。解酒護肝片是由靈芝、葛根、枳椇子、枸杞子組成。靈芝在中國藥典和醫學名著中,被稱之為:不老草、還魂草。因為靈芝有其獨特的解毒功效此外,靈芝又被稱之為解酒草(醒酒草),具有解