東方百合鱗片扦插誘導(dǎo)小鱗莖形成過(guò)程及其鱗片內(nèi)部糖和蛋白質(zhì)的分布

“東方百合”來(lái)自荷蘭。這朵花是粉紅色的，帶有味道（蔡素軍等，2005）。作為一種新鮮的花，它深受消費(fèi)者的喜愛(ài)（劉亞麗等，2004；楊勛等，2007）。鱗片扦插是其主要的繁殖方式,扦插過(guò)程中小鱗莖誘導(dǎo)的數(shù)量與鱗片的部位密切相關(guān)(Joungetal.,2001;王愛(ài)勤等,2004)。組織發(fā)育過(guò)程中糖和蛋白質(zhì)的分布變化僅在紅掌中有研究(陳超等,2008),其它植物中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)采用容易誘導(dǎo)小鱗莖的中層和外層鱗片為試材,探尋扦插過(guò)程中小鱗莖的形態(tài)發(fā)生過(guò)程,及在此過(guò)程中扦插鱗片內(nèi)糖和蛋白質(zhì)的分布特點(diǎn),以期能夠了解鱗片扦插誘導(dǎo)小鱗莖的形成機(jī)理,探究糖和蛋白質(zhì)對(duì)小鱗莖發(fā)生發(fā)育的影響,為東方百合小鱗莖的形成機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。1移植后的樣品處理試驗(yàn)于2005年12月1日—2006年1月1日在唐山師范學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行。以從荷蘭進(jìn)口的東方百合品種‘索邦’的種球?yàn)椴牧稀⒔?jīng)過(guò)低溫處理的種球外層和中層鱗片扦插于草炭∶蛭石為1∶1的基質(zhì)中,定期澆水保濕。從扦插4d開(kāi)始取樣,每隔2d(10—15日內(nèi)每隔1d)取樣1次,每次5片,一個(gè)月后停止取材。未經(jīng)扦插處理種球的外層和中層鱗片作對(duì)照。將鱗片洗凈,切取靠近基部1cm左右的部分立即置于卡諾固定液(無(wú)水乙醇∶冰乙醇=3∶1)中固定24h,然后轉(zhuǎn)入70%酒精中保存。不同時(shí)期扦插鱗片的基部用愛(ài)氏蘇木精整染,高碘酸席夫試劑(PAS法)和氯化汞—溴酚藍(lán)法分染。常規(guī)石蠟切片法制片,用LeicaRM2015切片機(jī)切片,厚度為12μm,郝普特明膠粘片劑粘片,加拿大樹(shù)膠封片。對(duì)所制整染和分染切片進(jìn)行觀察比較,并用DT2000圖像分析軟件照相分析。2結(jié)果與分析2.1財(cái)產(chǎn)發(fā)育時(shí)期的確立2.1.1小鱗莖的形成過(guò)程小鱗莖起源于近軸基部8~14層的薄壁細(xì)胞,為內(nèi)起源(圖版Ⅰ,1),靠近分生細(xì)胞團(tuán)的表皮細(xì)胞有破損現(xiàn)象。小鱗莖的形態(tài)發(fā)生過(guò)程依次經(jīng)過(guò)了啟動(dòng)時(shí)期(圖版Ⅰ,2)、生長(zhǎng)錐形成時(shí)期(圖版Ⅰ,3)、葉原基形成時(shí)期(圖版Ⅰ,4)和小鱗莖形成時(shí)期(圖版Ⅰ,5)。扦插鱗片的內(nèi)外側(cè)細(xì)胞有明顯區(qū)別:內(nèi)側(cè)為體積較大,排列疏松的薄壁細(xì)胞,外側(cè)細(xì)胞體積較小,排列密集(圖版Ⅰ,6)。鱗片扦插6d小鱗莖開(kāi)始啟動(dòng),出現(xiàn)分生細(xì)胞團(tuán),且分生細(xì)胞團(tuán)數(shù)較多,面積較小,此時(shí)期為小鱗莖的啟動(dòng)時(shí)期。扦插10d左右小鱗莖形成的部位與方向已初步確定,鱗片中部分分生組織細(xì)胞分裂現(xiàn)象明顯,分生細(xì)胞團(tuán)的面積擴(kuò)大,靠近分生細(xì)胞團(tuán)的鱗片表層細(xì)胞開(kāi)始分裂。鱗片扦插20d左右,出現(xiàn)生長(zhǎng)錐典型的原體原套結(jié)構(gòu),為生長(zhǎng)錐形成時(shí)期。扦插25d可觀察到葉原基的形成。扦插一個(gè)月左右可觀察到小鱗莖,為小鱗莖形成時(shí)期(圖版Ⅰ,5、7)。扦插鱗片能誘導(dǎo)形成多個(gè)小鱗莖,兩個(gè)小鱗莖之間存在縫隙(圖版Ⅰ,7)。另外,在小鱗莖形成過(guò)程中,高級(jí)分生組織的周圍常常伴有小的次級(jí)分生細(xì)胞團(tuán)(圖版Ⅰ,8),隨著高級(jí)分生細(xì)胞團(tuán)的分化,次級(jí)分生細(xì)胞團(tuán)逐漸消失。2.1.2小鱗莖形成的部位和方向扦插取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)小鱗莖多向鱗片內(nèi)側(cè)生長(zhǎng),個(gè)別向外生長(zhǎng)。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn),鱗片的內(nèi)層細(xì)胞較外層細(xì)胞的體積大(圖版Ⅰ,8),內(nèi)層表皮細(xì)胞常有破損現(xiàn)象(圖版Ⅰ,1)。小鱗莖的形成具有一定的方向性,鱗片基部存在較多分生細(xì)胞團(tuán)(圖版Ⅰ,9),分生細(xì)胞團(tuán)的位置決定它能否形成小鱗莖。中間和靠近外表皮的分生細(xì)胞團(tuán)發(fā)育成小鱗莖的幾率較小,小鱗莖多在扦插鱗片內(nèi)側(cè)形成。在啟動(dòng)時(shí)期,分生細(xì)胞團(tuán)向內(nèi)表皮一側(cè)生長(zhǎng),內(nèi)側(cè)表皮細(xì)胞被撐破,逐漸被分生細(xì)胞團(tuán)所取代。能夠繼續(xù)分化發(fā)育形成小鱗莖的分生細(xì)胞團(tuán)除了具有大量分生能力的細(xì)胞之外,一般都占據(jù)靠近近軸基部?jī)?nèi)表皮的有利位置。2.1.3小鱗莖形成過(guò)程中染色體的變化扦插10d,分生組織細(xì)胞核中染色體變化活躍,靠近內(nèi)表皮的分生細(xì)胞分裂旺盛。分生細(xì)胞的體積較未分化細(xì)胞大,這些細(xì)胞的染色體數(shù)明顯多于未分裂的細(xì)胞(圖版Ⅰ,10)。不能分化形成小鱗莖的分生細(xì)胞團(tuán)迅速衰退死亡,能夠發(fā)育形成小鱗莖的分生細(xì)胞團(tuán)迅速增殖,分生細(xì)胞團(tuán)不斷擴(kuò)大。此外還可觀察到各個(gè)時(shí)期的染色體的分裂相(圖版Ⅰ,11~13),中期染色體清晰可見(jiàn)。葉原基形成時(shí)期頂端分生組織分裂旺盛,如圖版Ⅰ,14所示生長(zhǎng)錐的原體原套結(jié)構(gòu)中頂端分生組織最外面一層進(jìn)行垂周分裂,內(nèi)部的細(xì)胞則進(jìn)行各種方向的分裂。2.2分生組織發(fā)生情況2.2.1PAS和氯化汞—溴酚藍(lán)分染的效果PAS和氯化汞—溴酚藍(lán)分染觀察,席夫試劑(PAS染色)使顆粒狀糖物質(zhì)和可溶性糖均著色,細(xì)胞內(nèi)的顆粒狀糖物質(zhì)呈深紅色,維管組織和細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖物質(zhì)呈淺紅色(圖版Ⅱ,1、2)。氯化汞—溴酚藍(lán)對(duì)蛋白質(zhì)的染色效果不是很好,因?yàn)樵囼?yàn)材料本身蛋白質(zhì)含量較低,只有細(xì)胞核所在部位輕微著藍(lán)色(圖版Ⅱ,3)。2.2.2分生組織及其周圍細(xì)胞的組織化學(xué)分析愛(ài)氏蘇木精整染發(fā)現(xiàn)分生細(xì)胞團(tuán)呈漩渦狀,細(xì)胞壁薄,體積小,細(xì)胞核較大,染色較深。PAS和氯化汞—溴酚藍(lán)分染發(fā)現(xiàn)分生細(xì)胞內(nèi)糖顆粒含量低,但蛋白質(zhì)的含量較高,主要集中于細(xì)胞核的部位。分生組織細(xì)胞間排列緊密,沒(méi)有細(xì)胞間隙(圖版Ⅱ,1~3)。其周圍的細(xì)胞則體積較大,細(xì)胞質(zhì)濃厚,細(xì)胞內(nèi)糖顆粒含量豐富,而蛋白質(zhì)含量少。蛋白質(zhì)和糖顆粒物質(zhì)在分生細(xì)胞及其周圍細(xì)胞之間存在著濃度梯度。對(duì)照組中(非分生組織中)糖和蛋白質(zhì)均勻分布。由于小鱗莖形成初期維管組織并未形成,分生細(xì)胞在分化時(shí)首先需要周圍的細(xì)胞供給營(yíng)養(yǎng)和能量,營(yíng)養(yǎng)在細(xì)胞之間發(fā)生流動(dòng),形成濃度梯度。分生細(xì)胞團(tuán)外一層較大的細(xì)胞幾乎不含糖顆粒,多糖已經(jīng)被分生細(xì)胞所利用(圖版Ⅱ,2)。分生細(xì)胞不斷產(chǎn)生新的細(xì)胞,周圍細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)不斷消耗而逐漸解體,分生細(xì)胞團(tuán)不斷擴(kuò)大,最終分化形成小鱗莖。2.2.3小鱗莖形成過(guò)程中維管組織的變化隨著分生細(xì)胞團(tuán)的不斷擴(kuò)大,在分生細(xì)胞團(tuán)周圍形成維管組織(圖版Ⅰ,4、15;圖版Ⅱ,4~6)。對(duì)照組未扦插鱗片細(xì)胞中糖和蛋白質(zhì)均勻分布,雖然也有維管組織的雛形,但并未見(jiàn)成形的維管組織。維管組織中顆粒性糖物質(zhì)(淀粉粒)和蛋白質(zhì)積累較少,可溶性糖含量高。另外,維管組織的發(fā)育與淀粉粒的含量有一定的關(guān)系。PAS染色發(fā)現(xiàn)維管組織周圍細(xì)胞中淀粉粒含量明顯高于其他部位,(圖版Ⅱ,1、4~6),可見(jiàn)淀粉粒含量高時(shí)有利于維管組織的形成,這些維管束組織主要為篩管(圖版Ⅰ,15)。篩管分子周圍細(xì)胞含較多的顆粒狀糖物質(zhì),糖分容易通過(guò)篩管分子運(yùn)輸?shù)椒稚M織,有利于分生細(xì)胞進(jìn)一步分化發(fā)育形成小鱗莖。2.2.4小鱗莖形成時(shí)期細(xì)胞內(nèi)糖和蛋白質(zhì)分布變化小鱗莖形成時(shí)期鱗片各處糖和蛋白質(zhì)分布不均勻,分染可觀察到糖顆粒與蛋白質(zhì)的分布情況(圖版Ⅱ,7~9),頂端分生組織由內(nèi)向外細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量降低,糖含量則升高。頂端分生組織在生長(zhǎng)過(guò)程中吸收周圍細(xì)胞的糖類作為能量來(lái)源。生長(zhǎng)錐新生鱗片中可溶性糖含量較多,新生葉片中可觀察到維管組織。頂端分生組織到周圍的細(xì)胞中,多糖的含量由低到高(圖版Ⅱ,8),這為分生組織吸收周圍細(xì)胞的糖分奠定了濃度梯度。生長(zhǎng)點(diǎn)頂端分生組織蛋白質(zhì)含量較多,蛋白質(zhì)主要集中于細(xì)胞核部位,此處細(xì)胞分裂非常旺盛(圖版Ⅱ,9)。3小臟器的誘導(dǎo)發(fā)育細(xì)胞所處的位置決定其生理活性,在本試驗(yàn)中,近軸基部8~14層的薄壁細(xì)胞容易分化形成分生細(xì)胞團(tuán),進(jìn)而形成小鱗莖,其它位置的細(xì)胞雖然能夠形成分生細(xì)胞團(tuán),但不易形成小鱗莖。小鱗莖的形成除了受分生細(xì)胞團(tuán)的位置影響外,還與分生細(xì)胞能否獲得充分營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。本試驗(yàn)中分生細(xì)胞團(tuán)本身含有大量的蛋白質(zhì),周圍則富含多糖。豐富的蛋白質(zhì)和多糖能夠?yàn)樾△[莖的誘導(dǎo)形成提供結(jié)構(gòu)物質(zhì)和能量保障。王愛(ài)勤等(2004)在扦插過(guò)程中用冰凍切片觀察發(fā)現(xiàn)小鱗莖發(fā)生的最早部位是正對(duì)鱗片主脈維管束的內(nèi)表皮,其次是側(cè)脈維管組織,可能與維管束是水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸系統(tǒng)有關(guān),越靠近輸導(dǎo)組織的部位越先獲得充足的營(yíng)養(yǎng),分化形成小鱗莖的幾率也越大,而營(yíng)養(yǎng)不能供應(yīng)的部位則退化,這與本試驗(yàn)所得結(jié)論一致。羅麗萍等(2001)在探究鱗片不同部位誘導(dǎo)小鱗莖的試驗(yàn)中得出,處于鱗片葉下部的細(xì)胞內(nèi)源激素水平高、貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,在同樣條件下,更易誘導(dǎo)出小鱗莖。分生細(xì)胞團(tuán)塊能否形成小鱗莖除了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)源激素含量及分布有關(guān),還有沒(méi)有其它原因促進(jìn)了小鱗莖的形成,有待于進(jìn)一步研究。小鱗莖形成過(guò)程中,寧云芬等(2003)認(rèn)為分生組織不經(jīng)愈傷組織階段可以直接形成小鱗莖。喬永旭等(2007)通過(guò)組培試驗(yàn)證實(shí)小鱗莖的形成可以經(jīng)過(guò)愈傷組織途徑。本次試驗(yàn)采取鱗片扦插,幾天后鱗片內(nèi)分生細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量迅速增多,細(xì)胞團(tuán)分化到一定程度后直接形成了小鱗莖,與寧云芬等(2003)的研究結(jié)果相一致。造成這種現(xiàn)象的原因可能由于鱗片所