免疫組織化學技術及其分析、免疫組化技術

免疫組化技術應用實驗步驟器材與試劑標本概論本卷須知1.1.1

原理

目的1.1.3

常用方法

1.1

概論應用免疫學根本原理—抗原抗體特異性結合的原理，通過化學反響使標記抗體的顯色劑顯色(標記物有酶,熒光素等).來確定組織細胞內抗原，對其進行定位，定性，定量的研究.

原理

目的

檢測組織細胞中相關抗原的分布及含量等即組織細胞中的待測抗原，參加由酶、熒光素等標記的抗體，形成抗原抗體復合物，參加顯色劑，在酶的催化下，顯色劑發生化學反響，形成有色的沉淀物，沉積在細胞上，根據其染色位置、深淺，檢測出待測抗原的分布區域以及含量等。

免疫組化常用方法組織抗原第一抗體第二抗體過氧化物酶直接法間接法

直接免疫熒光法間接免疫熒光法

免疫組化常用方法

器材：微波爐、高壓鍋、微量加樣器、修復盒、濕盒、染色架、免疫組化筆、防脫載玻片、蓋玻片、脫水機、切片機、石蠟包埋機、攤片機、烤片機、冰箱、電磁爐、計時器、微型漩渦震蕩儀。1.2

器材與試劑1.2

器材

1.PBS：0.01M磷酸鹽緩沖液〔PH=7.4)2.抗原修復液：0.01M檸檬酸鹽〔枸櫞酸鹽〕緩沖液〔PH=6.0)3.固定液：10%中性緩沖福爾馬林：〔甲醛1份+0.01MPH7.4的PBS9份配制而成)，4%多聚甲醛等。4.防脫劑：0.5%多聚賴氨酸。5.包埋劑：石蠟。6.一抗、免疫組化檢測試劑盒。7.TO生物透明劑、梯度酒精、3%H2O2、中性樹膠。8.顯色劑：蘇木素染液、DAB試劑等1.2

試劑1.3

標本組織標本細胞標本組織印片石蠟切片冰凍切片病理切片組織芯片細胞爬片細胞涂片石蠟切片是制作組織標本最常用、最根本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回憶性研究。染色1.4.41.4

實驗步驟免疫組織化學技術及其分析

抗原修復

1.4.3

脫蠟和水化1.4.2

石蠟切片制作1.4.1石蠟切片80%酒精〔3min)1.4.1脫蠟和水化無水乙醇〔3min)TO透明劑(10min)

95%酒精(3min)75%酒精(3min)PBS洗5min×3次)

免疫組織化學技術及其分析TO透明劑(10min)1.4.2抗原修復高壓鍋熱修復法微波加熱方法原理：通過熱能，在某些化學物質的作用下，翻開蛋白的交聯鍵，暴露抗體所識別的抗原決定蔟。方法：切片脫蠟至水后，放入盛有緩沖液的修復盒中，置微波爐中火煮10分鐘。冷卻或放在流水中冷卻.注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以免使蛋白恢復原有的空間構型。組織切片放入盛有抗原修復液的高壓鍋內,加筏后高壓2分30秒.此方法可快速翻開抗原決定簇,有利于抗原抗體的特異性結合,是目前常用的抗原修復方法。.１.4.3常用免疫組化染色方法SP法EnVision法EPOS法SABC法CSAII法19免疫組織化學技術及其分析

SP法SP法

1.特點：為生物素檢測系統，需封閉內源性生物素，三步法染色。2.試劑盒：包含生物素標記的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白工作液，標記HRP或AP的鏈菌抗生物素蛋白工作液3.染色步驟：〔1〕組織切片經脫蠟水化后，按以下步驟進行：〔2〕PBS洗，3分鐘×3次；〔3〕3%H2O2孵育10分鐘，以滅活內源性過氧化物酶的活性。〔4〕必要時進行抗原修復〔5〕PBS洗，3分鐘×3次；〔6〕正常血清封閉后滴加一抗，孵育30~40分鐘或4℃冰箱夜；〔7〕PBS洗，10分鐘×3次；〔8〕滴加鼠/兔/羊二抗，孵育20~30分鐘，〔9〕PBS洗，10分鐘×3次；〔10〕滴加鏈菌抗生物素蛋白/HRP三抗，常溫孵育30~40分鐘；〔11〕PBS洗，5分鐘×3次；〔12〕DAB顯色,可在顯微鏡下觀察染色程度；〔13〕常水洗凈；〔14〕擦干后蘇木素染色數分鐘；〔15〕流水沖洗；〔16〕鹽酸酒精分化，流水沖洗10分鐘；〔17〕脫水、透明、封片。1.4.5.1SP法

22免疫組織化學技術及其分析1.4.5.2EnVision法

EnVision法1.特點：為非生物素檢測系統，可防止內源性生物素干擾，不需要進行封閉內源性生物素操作，加一抗前也不需要正常血清封閉，具有敏感性高，操作簡便，非特異性染色少的優點。2.試劑盒:只有EnVision/HRP/鼠/兔二抗或EnVision/AP/鼠/兔二抗3.染色步驟：〔1〕組織切片經脫蠟水化后，按以下步驟進行：〔2〕PBS洗，3分鐘×3次；〔3〕3%H2O2孵育10分鐘，以滅活內源性過氧化物酶的活性。(4)必要時進行抗原修復(5)PBS洗，3分鐘×3次；(6)滴加一抗，孵育30~40分鐘或4℃冰箱夜；(7)PBS洗，10分鐘×3次；(8)滴加EnVision/HRP/鼠/兔二抗，常溫孵育30~40分鐘；(9)PBS洗，5分鐘×3次；(１０)DAB顯色,可在顯微鏡下觀察染色程度；(１１)常水洗凈；(１２)擦干后蘇木素染色數分鐘；(１３)流水沖洗；(１４)鹽酸酒精分化，流水沖洗10分鐘；(１５)脫水、透明、封片。EnVision法石蠟人乳腺導管癌ER染色，胞核陽性，SP法，DAB染色1.6應用石蠟，人甲狀腺癌CD44V6染色，胞膜陽性，SP法，DAB染色抗GBM腎小球腎炎，IgG呈細線狀毛細血管壁沉積，＋＋＋＋〔熒光×400〕局灶節段性腎小球硬化癥，IgM呈沉積于病變部位，＋＋＋＋〔熒光×400〕

免疫組織化學技術及其分析1.5本卷須知

抗體的保存免疫組化結果的判斷原那么引起假陰性與假陽性的主要原因

染色中的常見問題及對策本卷須知29

濃縮抗體：有效期內只需放在4℃冰箱內保存，時間達1-3年。

即用型抗體：理論上在4℃冰箱內可保存半年左右。

PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般只可放置1-2個月。1.5.1抗體的保存1.5.2染色中的常見問題及對策免疫組織化學技術及其分析1234567脫片;無特異性表達;表達較弱;染色過強;染色定位不好;非特異性背景染色;封片時的本卷須知;1.5.3.1脫片的可能原因與對策整批切片脫片單張切片及整塊組織脫片可能是載玻片未處理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脫片膠，或烤片時間缺乏致粘片不牢固。除了上述原因外，需考慮抗體熱修復時液體溫度過高和時間過長，或沖洗時用力過猛等因素。免疫組織化學技術及其分析※標本固定方式不當或固定時溫度過高，使局部組織抗原被破壞；※抗原修復方式不當；※抗體濃度過低，或者孵育的溫度、時間不夠；※沖洗后切片殘留多余緩沖液。如果陰性對照沒有反響，陽性對照反響良好，而標本弱陽性，應考慮查標本本身原因。※新鮮組織及時固定，防止自溶，固定時間不超過24小時；※封閉時間不超過10分鐘，或參考產品說明；※注意復染時間；※提高抗體濃度，孵育時間不少于60分鐘〔室溫低于15℃，改在37℃溫箱孵育或4℃冰箱過夜〕問題解決方法1.5.3.2表達較弱免疫組織化學技術及其分析※抗體濃度過高或孵育時間過長。※孵育溫度過高，＞37℃

※顯色速度過快或顯色時間過長；※降低抗體濃度、孵育時間；※室溫1小時或4℃過夜；※縮短顯色時間；顯色時間不超過5～10分鐘，以顯微鏡下觀察為準；問題解決方法1.5.4.4染色過強免疫組織化學技術及其分析※操作過程中沖洗不充分；※加試劑后切片枯燥；※組織切片折疊；※組織中含過氧化物酶未阻斷；※組織中含內源性生物素；※組織抗原彌散；※切片粘附劑過厚；※血清蛋白封閉不充分；※每步沖洗3×5′；※防止切片枯燥〔必要時重做〕；※勿以折疊處觀察染色結果；※可