豬疫病診斷技術圓環病毒范圍本文件描述了豬圓環病毒1型（PorcineCircovirusType1，PCV1）、2型（PorcineCircovirusType1，PCV2）和3型（PorcineCircovirusType3，PCV3；）的熒光PCR檢測及鑒別檢測技術。本文件適用于豬圓環病毒1型、2型和3型的快速分子診斷。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。試劑或材料水：符合GB/T6682中規定的一級水。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.27?g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.42?g、氯化鈉（NaCl）8?g、氯化鉀（KCl）0.2?g，加滅菌水約800?mL充分攪拌溶解，加入濃鹽酸調pH至7.4，定容至1?000?mL。核酸提取試劑：市售病毒DNA/RNA提取試劑盒或磁珠法提取試劑盒。熒光PCR試劑盒。儀器設備熒光定量PCR儀。震蕩研磨儀。高速冷凍離心機：離心力≥8?000?g。電子天平：精度0.000?1?g。生物安全柜。冰箱：2?℃～8?℃，-20?℃以下和-70?℃以下。渦旋振蕩器。診斷方法臨床診斷流行特點豬是PCV的天然宿主，各種年齡、不同性別的豬都可以感染，但以哺乳期和育成期的豬最易感。病豬和帶毒豬是主要的傳染源，可經口腔、呼吸道、精液感染不同日齡的豬，少數孕豬還可經胎盤垂直傳播。臨床癥狀斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）引起斷奶期進行性消瘦、皮膚蒼白、呼吸困難、厭食、精神沉郁、被毛粗亂、出現以咳嗽、噴嚏、呼吸加快及呼吸困難為特征的呼吸障礙，10?%～20?%豬的皮膚和可視粘膜可見黃疸，豬群的死亡率增加，體表淋巴結，特別是腹股溝淺淋巴結腫大，有的還表現腹瀉和中樞神經癥狀。其它臨床癥狀，包括咳嗽、發熱、胃炎、腦膜炎及突然死亡。豬腎病與皮炎綜合征（PDNS）斷奶仔豬和育肥豬食欲減退，有時體溫上升，皮下水腫，皮膚表面出現圓形或不規則形隆起，紅色或紫色、中央發黑的斑塊。破損皮膚常融合成大的塊。通常病變在后肢、腹部首先發現，然后慢慢向胸、耳等部位擴展。剖檢，在大部分死亡豬中，可見雙腎腫大、蒼白、皮質有出血小點。仔豬的先天性震顫（CT）出生后3周齡仔豬，因痙攣而出現步態異常姿勢，從雙耳，被毛和尾巴等發抖，發展到全身肌肉有節奏性扭擺，后肢嚴重痙攣，呈跳躍運動等。欲稱“仔豬跳跳病”或“仔豬抖抖病”，是仔豬剛出生不久，出現全身或局部肌肉陣發性攣縮的一種疾病。另一種表現是后肢肌肉呈強直性痙攣，后肢分開，似犬坐姿勢，尾部輕微震顫，病豬可在3周內康復。豬增生性和壞死性肺炎（PNP）與保育豬和育肥豬發生的呼吸道病有關。PNP的確診主要依據組織病理學變化，表現為增生性和壞死性肺炎，病豬主要表現呼吸困難，肺臟見點狀出血。病理診斷剖檢病變為豬只消瘦，貧血，皮膚蒼白，黃疸，最顯著的剖檢變化是全身淋巴結腫大，特別是腹股溝淺淋巴結、腸系膜淋巴結、氣管支氣管淋巴結及下頜淋巴結腫大2～5倍，有時可達10倍。切面硬度增大，可見均勻的白色，所有病例幾乎都能看到肺萎縮不全，重量和硬度增加，部分病例尖葉有固質化、致密的病灶，肺有輕度的多灶性或高度的彌漫性間質肺炎。肺臟腫脹，堅硬似橡皮樣；肝臟發暗，肝小葉間結締組織增生。肝臟最常見到門脈周圍淋巴細胞、組織細胞浸潤，具有竇狀隙內單核炎性細胞集聚和肝細胞的單細胞壞死為特征的肝炎。慢性死亡病例，由于黃疸而使肝小葉周圍纖維化，肝細胞壞死、消失及單核細胞彌漫性浸潤。腎臟水腫、蒼白，被膜下有壞死灶。顯微鏡觀察，淋巴結的皮質區及副皮質區顯著擴張，有單核和巨噬細胞浸潤，有時散布有大量的多核巨細胞，有些淋巴細胞萎縮，少數情況還有壞死。肝臟表現不同程度的炎癥，有淋巴細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞浸潤；腎臟的皮質和髓質也有炎癥存在。實驗室診斷樣品采集細胞培養樣品按照GB19489規定，取細胞培養樣品。剖檢樣品按照NY/T541規定采集病死豬的淋巴結、脾臟、腎臟和肺臟等組織樣品。樣品的保存及運輸樣品2?℃～8?℃貯藏。樣品保存在2?℃～8?℃條件下不超過24?h，-20?℃以不超過3個月，-70?℃以下不超過5年。必須低溫保存運輸樣品，且在規定溫度下的保存期內送達和檢測。樣品處理淋巴結、脾臟、腎臟和肺臟等組織樣品取適量大小的組織塊放入盛有500?μLPBS（4.2）的研磨管中，6?000?r/min震蕩研磨45?s，制成約10?%的組織勻漿液，5?000?r/min離心5?min，上清液備用。細胞培養樣品將細胞培養樣品反復凍融3次，3?000?r/min離心5?min，棄去細胞碎片，上清備用。試驗步驟核酸提取采用DNA提取試劑盒提取各類樣本中的病毒核酸。如在2?h內檢測可將提取的核酸置于冰上保存，否則應置于-20?℃冰箱保存，具體操作步驟如下：取上清液（6.3.3）200?μL置于1.5?mL離心管中，加入500?μL裂解液，在渦旋振蕩器上振蕩30?s混勻，室溫靜置2?min；裂解后的液體移入吸附管柱，6?000?r/min，離心5?min；此時病毒DNA會吸附再管柱底部的膜上。加500?μL洗液至管柱上，6?000?r/min，離心5?min，棄去洗液；重復上一步驟1次；8?000?r/min離心10?min，去除殘留在膜上的乙醇；將吸附柱轉移至新的離心管中，開蓋室溫靜置2?min；加入50?μL洗脫液，室溫靜置1?min；將含有吸附柱的離心管，8?000?r/min離心1.5?min，得到DNA。熒光PCR擴增設25?μL反應體系，熒光PCR擴增反應液體系見表1，熒光PCR擴增引物參見附錄A。熒光PCR擴增反應液體系序號組分用量12×SYBR?GreenProTaqHSPremix*612.5210?μMPCV-F1.0310?μMPCV1-R1.0410?μMPCV2-R1.0表1熒光PCR擴增反應液體系（續）序號組分用量510?μMPCV3-R1.06模板DNA1.57ddH2O7檢測設置陽性、陰性對照，熒光定量PCR擴增反應條件見表2。熒光定量PCR擴增反應條件序號進程反應條件反應時間1預變性95?℃30?s2變性95?℃30?s3退火62?℃30?s4延伸72?℃10?s5循環數（2～4）40—6信號采集退火時采集—結果判定結果分析條件設定直接讀取檢測樣品的熔解曲線峰值溫度，溫度誤差0.1?℃范圍內。質控標準陽性對照參見附錄B。陰性對照熔解曲線無峰值。樣品檢測結果分析在陽性和陰性成立前提下，樣品檢測結果判定如下：熔解曲線峰值溫度為84?℃，則樣品中含有PCV1；熔解曲線峰值溫度為85?℃，則樣品中含有PCV2；熔解曲線峰值溫度為82?℃，則樣品中含有PCV3；熔解曲線峰值溫度為84?℃和85?℃，則樣品中含有PCV1和PCV2；熔解曲線峰值溫度為84?℃和82?℃，則樣品中含有PCV1和PCV3；熔解曲線峰值溫度為85?℃和82?℃，則樣品中含有PCV2和PCV3；熔解曲線峰值溫度為84?℃、85?℃、82?℃，則樣品中含有PCV1、PCV2和PCV3。

（規范性）

熒光PCR擴增引物熒光定量PCR擴增引物見表A.1。熒光定量PCR擴增引物引物名稱序列PCV-F5’-TKGATGATYTTTTATGGSTGG-3’PCV1-R5’-GTCAGCAGTTGAGGACTACCATT-3’PCV2-R5’-AGTAATCCGCCGATAAAGAGC-3’PCV3-R5’-CTCCTAAACAAGGCCTCCAACT-3’簡并堿基K：G/T；Y：C/T；S：G/C

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