四逆湯甘草苷、甘草酸含量的比較

四逆湯是張仲景“傷寒論”治療少陰寒虛證的主要方針。四逆湯由炮附子、干姜、炙甘草(3∶2∶3)組成,是中醫回陽救逆的經典名方,具有強心、抗休克作用。現代臨床觀察和藥理研究表明,四逆湯能保護心肌、改善心功能、防止缺血-再灌注的損傷,特別是對冠心病、心絞痛患者的對癥治療很有效果。文獻報道附子生物堿是四逆湯有效成分組合中的關鍵因素,但干姜揮發油和甘草酸粗品也是組方中不可或缺的因素。因此,為考察不同提取方法制備的四逆湯中有效成分的提取率,本文以炙甘草中黃酮類成分甘草苷、甘草酸為指標成分之一,測定其含量;對傳統水提法、藥典收錄的水提醇沉法及針對各單味藥有效成分分別提取后合并制備的四逆湯中甘草苷、甘草酸的含量進行了測定。1藥材、藥品與材料Agilent1200型高效液相色譜儀(包括脫氣機、四元泵、自動進樣器、恒溫箱、DAD檢測器),ChemStation色譜工作站,KQ-250E型醫用超聲波清洗器(群山市超聲儀器有限公司),國華恒溫振蕩器,AF240型電子天平(瑞士梅特勒公司),RE-52C型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。藥材購于山東濟南建聯藥店,均經山東中醫藥大學李峰教授鑒定為道地藥材。黑附子(毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的炮制加工品)、干姜(姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的干燥根莖)(產地四川),炙甘草(豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的炮制加工品,產地內蒙古),甘草苷對照品和甘草酸銨對照品(成都曼思特生物科技有限公司,批號分別為A0040和A0039,含量均>98%),實驗用水為蒸餾水,色譜用水為娃哈哈純凈水,乙腈、甲醇、磷酸為色譜純,其他試劑均為分析純。2方法和結果2.1流動相梯度a-乙腈-磷酸水體系內標物柱相梯度如表1AglientZorbaxSB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),柱溫25℃,檢測波長237nm,流速1.0mL·min-1,進樣量10μL,流動相A-乙腈,B-0.05%磷酸水,梯度洗脫,梯度程序見表1。理論塔板數按甘草苷峰計算不低于5000,各待測組分峰與相鄰成分峰的分離度均符合規定。2.2溶液的制備2.2.1對照品儲備液的制備精密稱取甘草苷和甘草酸銨對照品適量,分別加70%乙醇制成每1mL中含甘草苷1.05mg和甘草酸銨1.18mg甘草酸銨的對照品儲備液。分別精密吸取上述儲備液適量于量瓶中,用70%乙醇稀釋至所需質量濃度(甘草苷0.0525g·L-1,甘草酸銨0.059g·L-1),即得2種組分的對照品溶液。2.2.2試驗溶液的制備2.2.2.制備流程樣品溶液取藥材粗粉(過20目篩)黑附子12g,炙甘草12g,干姜8g,加8倍量水浸泡1h,煎煮30min,過濾,殘渣加6倍量水煎煮20min,過濾,濾液合并,濃縮至60mL,冷藏備用。2.2.2.提取液1h取藥材粗粉(過20目篩)黑附子12g,炙甘草12g,加8倍量水加熱回流提取2h,過濾,殘渣加6倍量水加熱回流提取1h,過濾,濾液合并。取藥材粗粉(過20目篩)干姜粉末8g,置于250mL燒瓶中,加12倍量水,水蒸氣蒸餾提取5h,揮發油和蒸餾后水溶液備用,殘渣加6倍量水煎煮1h,過濾,煎液合并再與附子、炙甘草提取液合并,濃縮至60mL,加無水乙醇180mL,靜置10h后離心,得上清液,將其旋蒸濃縮至60mL,冷藏備用。2.2.2.黃酮類、揮發油的提取黑附子中生物堿的提取:藥材粗粉(過20目篩)12g,精密稱定,24倍量pH1.0酸水提取2次,振蕩浸提,每次1.5h,過濾,合并濾液并濃縮至約30mL。炙甘草中黃酮類的提取:藥材粗粉(過20目篩)12g,精密稱定,20倍量0.3%氨水-60%乙醇加熱回流提取4次,每次2h,過濾,合并濾液并濃縮至約30mL。干姜中揮發油的提取:藥材粗粉(過20目篩)8g,精密稱定,14倍量水,浸泡3h后水蒸氣蒸餾提取5h,揮發油和蒸餾后水溶液備用,殘渣加6倍量水煎煮1h,煎液與上次蒸餾后水溶液合并,濃縮至約20mL。將各單味藥提取液轉移合并為80mL,冷藏備用。2.2.2.靜置甘草藥材量的測定取傳統提取液2mL,藥典提取液2mL,各單味藥分提合并液2.67mL(折合炙甘草藥材量0.4g)分別置于25mL量瓶中,加70%乙醇定容至刻度,混勻靜置過夜。過濾,取續濾液,經0.45μm微孔濾膜濾過,即得復方供試品溶液1~3。2.3方法的線性回歸方程分別取2.2.1項下甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液1,2,4,6,8,10μL,甘草苷、甘草酸銨對照品溶液1,2,5,10,15,20μL,按2.1項下色譜條件測定,記錄峰面積。以對照品量X對色譜峰面積Y進行線性回歸,結果甘草苷和甘草酸銨的線性回歸方程分別為Y=2637084.94X+8.81,(r=0.9996);Y=686194.11X-2.26(r=1.0000)。線性范圍分別為0.0525~0.525μg和0.059~1.180μg。2.4進樣精密度試驗取2.2.1項下甘草苷和甘草酸銨對照品溶液10μL,按2.1項下色譜條件測定,連續進樣5次,測得甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.2%,0.1%,表明精密度良好。2.5外標法確定甘草苷和甘草酸銨含量取同一批號的藥材6份(黑附子3g,炙甘草3g,干姜2g)精密稱取,按2.2.2.1項下方法制備傳統復方提取液,按2.1項下色譜條件測定,按外標法分別計算甘草苷和甘草酸銨的含量,測得含量分別為2.543,1.902mg·g-1,RSD分別為0.3%,0.5%(n=5)。2.6加樣穩定性試驗取同一批號的藥材6份(黑附子3g,炙甘草3g,干姜2g)精密稱取,按2.2.2.1項下方法制備傳統復方提取液,于室溫下在同一天不同時間點(0,2,4,8,12h)分別進樣10μL,并于12h進樣后置4℃冰箱保存,于24h后取出進樣10μL,結果甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.8%,0.9%,表明供試品溶液在24h內穩定。2.7加樣回收率和rsd取已知含量的同一批藥材6份,每份黑附子0.2g,炙甘草0.2g,干姜0.13g(含甘草苷、甘草酸質量分數分別為2.545,1.860mg·g-1),分別加入甘草苷對照品溶液1mL(0.525g·L-1),甘草酸銨對照品溶液700μL(取1.18g·L-1母液稀釋2倍,0.590g·L-1),按2.2.2.1項下方法制備傳統復方提取液,同一色譜條件進樣10μL,按外標法測定其含量,計算平均加樣回收率和RSD。結果見表2。2.8復方供試品溶液的制備取四逆湯各藥材粗粉適量,按2.2.2項下方法制備復方供試品溶液1~3,按2.1項下色譜條件測定。按外標法分別計算供試品溶液中甘草苷和甘草酸銨的含量(mg·g-1)。結果見圖1和表3。3揮發油的提取本實驗針對傳統復方提取法及藥典提取法進行分析。傳統法多為群藥合煎,存在有效成分提取率不高,毒性成分減毒機制不明,揮發性成分散失等不足;藥典收錄的四逆湯合劑的制備方法為水提醇沉(揮發油單提后合并),會造成成分損失。經檢索相關文獻,根據各單味藥所含成分的化學性質,對黑附子中生物堿采用酸提取,炙甘草皂苷類成分采用氨醇提取,干姜揮發油單獨提取后、保留水提液,將各單藥提