一氧化氮供體非甾體抗炎藥抗腫瘤藥理學(xué)研究

非體抗炎藥物（nid）是治療風(fēng)濕性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的重要藥物，能抑制炎前列腺素（pgs）的生物合成，改善炎癥部位的充血、腫脹和疼痛癥狀。近年來的研究表明,傳統(tǒng)的NSAIDs除了具有良好的抗炎作用外,還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活免疫系統(tǒng)等許多生物活性,如對(duì)結(jié)腸癌有很好的預(yù)防作用。然而,NSAIDs選擇性差,對(duì)胃腸道有抑制作用,因此長期大量服用該類藥物可導(dǎo)致胃腸道潰瘍、出血甚至穿孔等不良反應(yīng),從而限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。一氧化氮(nitricoxide,NO)是體內(nèi)重要的小分子信使物質(zhì)和效應(yīng)分子,在神經(jīng)信息的傳遞、血管以及免疫功能的調(diào)節(jié)等方面具有重要的生物學(xué)功能。隨著對(duì)NO研究的深入,NO與腫瘤生物學(xué)的關(guān)系,特別是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用引起了人們的關(guān)注。NO可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;在胃腸道系統(tǒng)中,NO發(fā)揮著與PGs相似的調(diào)節(jié)黏膜完整性和黏膜血流量的作用,從而保護(hù)胃腸道黏膜。NO供體型NSAIDs(NO-NSAIDs)的設(shè)計(jì)思路是:將療效確切的傳統(tǒng)NSAIDs和NO供體通過一些連接基團(tuán)(spacer)相連,其在胃腸道易受NSAIDs損傷的部位釋放NO,從而保護(hù)胃腸道黏膜。隨著對(duì)NO-NSAIDs研究的深入,人們發(fā)現(xiàn),該類藥物除了有益于炎癥治療外,也能有效用于癌癥的預(yù)防和治療。常用的NSAIDs是一些含羧基或烯醇羥基的藥物,如阿司匹林(ASA)、布洛芬、萘普生、吡羅昔康等;NO供體包括硝酸酯(R-ONO2)、亞硝酸酯(R-ONO)、亞硝基硫醇(R-SNO)等,其中最常用的是硝酸酯;而常用于NO-NSAIDs的連接基團(tuán)為脂肪烴基或芳香烴基,它們通過酯鍵或酰胺鍵將二者連接起來,如NO-ASA(見圖1)。1no-nsids的保護(hù)模式NO-NSAIDs不僅具有母體NSAIDs的藥理學(xué)特性,還具備母體藥物所沒有的特性,即因NO可作為細(xì)胞毒分子,而具有殺滅癌細(xì)胞活性,但對(duì)正常細(xì)胞具低毒性。Yeh等進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究顯示,多數(shù)NO-NSAIDs對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制活性是母體NSAIDs的10～20倍,而受試藥物中NO-ASA的抑制活性最強(qiáng),其在72小時(shí)內(nèi)對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)小于10μmol/L,而ASA的IC50值則大于2500μmol/L。這一結(jié)果表明NO-NSAIDs的抗癌活性可比其母體藥物增加幾百倍。當(dāng)然,NO-NSAIDs對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制作用并不僅局限于對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系,其對(duì)多種癌細(xì)胞系均有活性。有學(xué)者將NO-ASA、NO-舒林酸、NO-布洛芬、NO-吲哚美辛與它們相應(yīng)的母體藥物對(duì)胰腺、結(jié)腸、膀胱、前列腺和肺等幾種人類癌細(xì)胞系的抑制作用進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),每一個(gè)NO-NSAIDs都能抑制所有受試癌細(xì)胞系的生長,且除了NO-舒林酸與其母體藥物對(duì)肺癌細(xì)胞系生長的抑制活性無差異外,其他NO-NSAIDs對(duì)各種癌細(xì)胞系的抑制活性均是其母體藥物的10～6000倍。在NO-NSAIDs中,NO-ASA對(duì)癌細(xì)胞系生長的抑制活性最強(qiáng),但對(duì)肺癌細(xì)胞系除外。2no-ns戰(zhàn)略體外研究顯示,NO-ASA能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致腫瘤生長受到顯著抑制。目前,NO-NSAIDs抗腫瘤作用的分子機(jī)制仍然不十分明確,但大量研究已經(jīng)揭示了其中部分作用靶點(diǎn):Wnt信號(hào)通路、核因子-κB(NF-κB)、一氧化氮合酶(NOS)、環(huán)氧合酶(COX)、Keap1-Nrf2通路和細(xì)胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激酶(MAPK)通路。2.1no-asa的機(jī)制作用Wnt信號(hào)通路調(diào)控著細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)和分化,已被確認(rèn)是與腫瘤發(fā)生相關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵性信號(hào)通路,在結(jié)腸癌發(fā)生過程中起著重要作用。研究數(shù)據(jù)顯示,β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的核表達(dá)變化與潰瘍性結(jié)腸癌之間有密切聯(lián)系。Wnt信號(hào)通路分為Wnt經(jīng)典通路和Wnt非經(jīng)典通路,其中對(duì)前者,即Wnt/β-連環(huán)蛋白通路,研究得較為深入。該經(jīng)典通路在進(jìn)化過程中高度保守,主要成分包括細(xì)胞外因子Wnt蛋白、7次跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled,Fz)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)、胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白(disheveled,Dsh)、糖原合成酶激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)、支架蛋白axin/conductin、結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoli,APC)、酪蛋白激酶1α(caseinkinase1α,CK1α和T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(Tcellfactor/Lym-phoidenhancerfactor,Tcf/Lef)轉(zhuǎn)錄因子家族。作為配體的膜外Wnt蛋白結(jié)合并激活Fz受體,后者繼而使Dsh磷酸化,而磷酸化的Dsh蛋白與軸蛋白(Axin)結(jié)合,阻止β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合體(主要由APC、Axin、GSK-3β構(gòu)成)的形成,抑制了β-連環(huán)蛋白在胞質(zhì)內(nèi)的正常磷酸化降解過程,致使大量積聚于胞質(zhì)內(nèi)的未磷酸化β-連環(huán)蛋白在Bcl-9/pygopus因子的協(xié)助下發(fā)生核轉(zhuǎn)位,與Tcf/Lef因子結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體,激活特定靶基因的轉(zhuǎn)錄,如原癌基因c2myc以及周期素D1(cyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP7)、存活素(survivin)、生長因子等蛋白基因,從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平,影響細(xì)胞的增殖與存活(見圖2)。研究表明,NO-ASA的3個(gè)異構(gòu)體,即NO供體基團(tuán)—CH2ONO2分別處在苯環(huán)的鄰、間、對(duì)位,均能抑制β-連環(huán)蛋白的信號(hào)傳導(dǎo),其IC50值均在1.1～15μmol/L之間,遠(yuǎn)小于母體ASA(>5mmol/L);NO-ASA通過阻斷Tcf與β-連環(huán)蛋白之間的結(jié)合而影響信號(hào)傳導(dǎo),但并不影響二者的表達(dá)量;而NO-ASA去硝基后對(duì)二者活性影響很小,外源性的NO供體則可以很好地模擬NO-ASA的這種作用。由此可以推斷,NO-ASA可能是通過對(duì)Tcf和β-連環(huán)蛋白的硝基化而阻礙二者空間上的結(jié)合,并最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性的降低。而且實(shí)驗(yàn)還顯示,SW480結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)NO-ASA處理之后,其周期素D1表達(dá)下調(diào)。值得注意的是,NO-ASA抑制信號(hào)傳導(dǎo)的半數(shù)有效量是其抑制細(xì)胞生長半數(shù)有效量的1%～4%,即NO-ASA以很小的濃度就可完全抑制關(guān)鍵的信號(hào)通路。2.2免疫抑制劑的篩選NF-κB參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,與炎癥反應(yīng)免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡有關(guān)。正常情況下,在大多數(shù)細(xì)胞中NF-κB與抑制蛋白(IκB)結(jié)合成復(fù)合物定位于胞質(zhì)中;在特定刺激因素作用下,因IκB被迅速磷酸化,并經(jīng)過短暫的泛素化修飾后被蛋白酶降解,使NF-κB從復(fù)合物中釋放出來,轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi),結(jié)合于特定基因序列,啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。對(duì)多種癌細(xì)胞的研究表明,NO-ASA顯著抑制NF-κB的激活及其與特定DNA序列之間的相互作用,并且這些活性與腫瘤細(xì)胞生長抑制效應(yīng)具相關(guān)性。2.3inos抑制劑特點(diǎn)機(jī)體內(nèi)存在3種NOS,即eNOS、nNOS及iNOS,它們均能催化L-精氨酸末端胍基上的氮氧化生成NO。iNOS存在于多種腫瘤細(xì)胞系和實(shí)體瘤組織中,它與p53突變以及COX-2的調(diào)控存在密切聯(lián)系,且其在腫瘤組織中的表達(dá)高于在非腫瘤組織中,而其抑制劑可抑制腫瘤的發(fā)展。Spiegel等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),NO-ASA不僅能抑制HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞中iNOS的表達(dá),而且能濃度依賴性地抑制其活性,從而導(dǎo)致癌細(xì)胞生長的抑制。2.4cox-2在乳腺癌治療pgs治療中的應(yīng)用COX-2被認(rèn)為是一種重要的腫瘤生長調(diào)節(jié)因子,它的翻譯和表達(dá)受著許多因素調(diào)控。研究表明,COX-2的過度表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。APC、ras、p53等基因的突變均可使COX-2的表達(dá)水平升高,從而催化合成大量的PGs,導(dǎo)致細(xì)胞增殖。COX-2選擇性抑制劑可抑制結(jié)腸癌的發(fā)生,其中抑制劑celecoxib已被臨床用于治療家族性腺瘤性息肉病。雖然有眾多證據(jù)表明COX-2的上調(diào)在癌癥發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要地位,但Williams等研究發(fā)現(xiàn),NO-ASA可濃度依賴性地誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)和增加其活性,在接近對(duì)腫瘤的IC50濃度下可致COX-2的表達(dá)量增加9倍。這一結(jié)果使我們不得不重新審視COX-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所起的作用以及NO-ASA通過調(diào)控COX-2而產(chǎn)生的抗癌作用機(jī)制。2.5nrf2基因表達(dá)對(duì)化學(xué)致病性的影響轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)和它的胞質(zhì)接頭蛋白Keapl是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞性調(diào)節(jié)者,Nrf2通過與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相互作用,誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶的表達(dá),在細(xì)胞的防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用。化學(xué)致癌物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化是依靠肝臟的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶來完成,而作為對(duì)化學(xué)防癌劑的應(yīng)答反應(yīng),Nrf2首先從Keap1上解離,然后發(fā)生核轉(zhuǎn)位,與小Maf蛋白形成二聚體,再與Ⅱ相代謝酶基因上游的ARE結(jié)合,誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶基因的表達(dá),這是化學(xué)防癌的重要機(jī)制。Gao等在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),NO-ASA呈濃度依賴性地誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶的表達(dá)并增強(qiáng)其活性,且Nrf2的核轉(zhuǎn)位與Ⅱ相酶表達(dá)密切相關(guān)。故他們認(rèn)為,NO-ASA的抗癌機(jī)制可能與Keap1-Nrf2通路有關(guān),即通過作用于Keap1-Nrf2復(fù)合物促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位(見圖3),從而誘導(dǎo)NADP(H)醌氧化還原酶(NQO)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的表達(dá)和激活,發(fā)揮抗癌作用。2.6c-亂世、p8-pa和no-asa抑制劑的激活和激活c-digital-1/2和3g-pa的磷酸化MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路在真核生物細(xì)胞的生長和分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。Hundley等研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)NO-ASA處理后,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)和Akt被激活,同時(shí)更大程度地激活了c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38MAP激酶,并致下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的磷酸化,激活轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF-2),最終抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞生長;且單一的JNK或p38抑制劑無法逆轉(zhuǎn)NO-ASA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制作用,需要同時(shí)沉默p38和JNK基因才能消除這種作用。因此,他們認(rèn)為,NO-ASA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用同時(shí)依賴于MAPK通路中p38和JNK的激活。3no-nsaids的安全性評(píng)價(jià)臨床上常用的抗腫瘤藥物大多數(shù)以傳統(tǒng)的核酸及蛋白為靶點(diǎn),選擇性差,毒副作用強(qiáng),作用機(jī)制單一,容易產(chǎn)生耐藥性,因此尋找高效低毒的藥物成為腫瘤防治中迫切需要解決的問題。而NO-NSAIDs就是一類極具開發(fā)價(jià)值的抗腫瘤藥物,其優(yōu)勢(shì)在于:①具有強(qiáng)于母體NSAIDs的抗腫瘤活性,可有效防治腫瘤;②可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用,而非單一靶點(diǎn)的作用機(jī)制,因此不易產(chǎn)生耐藥性;③具有良好的安全性。目前NO-NSAIDs的研究已取得可喜成效,但尚存有待破解的疑惑:NO-NSAIDs中的NO在體內(nèi)究竟如何釋放,NO在抗腫