馬崗鵝產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi)氣泡發(fā)育的內(nèi)分泌調(diào)控機制

鳥類的產(chǎn)卵性能主要取決于發(fā)育到發(fā)育階段的卵數(shù)。研究表明,禽類卵泡的發(fā)育主要受垂體促卵泡素(Folliclestimulatinghormone,FSH)和促黃體素(Luteinizinghormone,LH)控制,前者促進小卵泡進入等級發(fā)育階段,后者促進類固醇激素合成和分泌。在卵泡等級發(fā)育過程中,雌激素生成能力在早期對FSH反應性較高時最高,到后期越來越低;孕酮(Progesterone,P4)生成能力則相反,在卵泡發(fā)育過程中逐漸升高,最后高水平P4通過正反饋使垂體分泌排卵前LH高峰。研究發(fā)現(xiàn),雞的P4水平在開產(chǎn)前7d會明顯上升,停產(chǎn)前下降。在卵泡發(fā)育過程中,顆粒細胞還分泌肽類激素抑制素(Inhibin,INB)、活化素(Activin)和卵泡發(fā)育抑制因子(Follistatin),其中INB對家禽卵泡的發(fā)育具有很大影響,具有抑制FSH分泌的作用。動物體內(nèi)INB的主要來源是最大的排卵前卵泡。對禽類卵泡發(fā)育影響較大的另一內(nèi)分泌因子是催乳素(Prolactin,PRL),它是就巢啟動和維持的關(guān)鍵激素。就巢時高水平PRL能抑制下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotrophinreleaseinghormone,GnRH)的分泌,降低垂體促性腺激素特別是LH的分泌,使卵泡因缺乏LH而不能進入等級發(fā)育,降低產(chǎn)蛋性能,此外PRL還能直接抑制卵泡發(fā)育。研究顯示,通過免疫中和PRL或抑制其分泌能解除PRL對下丘腦GnRH分泌和對卵泡發(fā)育的抑制作用并提高產(chǎn)蛋性能。本研究以馬崗鵝為研究對象,對產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi)的卵泡發(fā)育和相關(guān)激素進行了研究,并通過對其主動免疫PRL重組蛋白和開產(chǎn)后延長光照促進PRL分泌研究了對產(chǎn)蛋和就巢的影響,以期在一定程度上揭示馬崗鵝產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi)卵泡發(fā)育的內(nèi)分泌調(diào)控機制,增進對禽類卵泡發(fā)育和就巢發(fā)生控制機制的認識。1材料和方法1.1不同免疫方法對虎林市虎群的免疫影響試驗1:挑選健康的就巢馬崗種鵝66只進行人工強制終止就巢,試驗開始。從第1天起每7d對母鵝進行翅下靜脈采血1次(n=12)。記錄每天的產(chǎn)蛋數(shù)(包括破蛋和軟殼蛋)和就巢數(shù),并在產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi)的就巢期(第1天)、就巢終止期(第10天)、開產(chǎn)期(第25天)、產(chǎn)蛋高峰期(第40天)、停產(chǎn)期(第55天)和就巢期(第70天)隨機挑選6只母鵝解剖,觀察卵巢形態(tài)及卵泡發(fā)育,統(tǒng)計卵泡類型及數(shù)量。卵泡類型分為大黃卵泡(LYF,直徑>20mm)、小黃卵泡(SYF,10mm≤直徑≤20mm)和大白卵泡(LWF,6mm≤直徑≤10mm)。試驗2:從處于繁殖期(光照時間為11h)的馬崗種鵝群中隨機挑選72只正在就巢的健康母鵝,平均分成免疫組和對照組。在試驗第1、23和45天進行3次免疫,免疫組免疫原為本課題組構(gòu)建并表達純化的重組PRL融合蛋白(含雞PRL成熟肽全部199個氨基酸殘基)與礦物油的混合乳液,3次免疫的PRL蛋白免疫劑量依次為1、0.8和0.5mg·只-1。對照組所接種的免疫原為牛血清白蛋白(BSA)與礦物油的混合乳液。在首次免疫后對母鵝進行人工強制終止就巢,以促進其重新開產(chǎn)。從試驗第1天起每隔15d對母鵝進行翅下靜脈隨機采血1次(n=12)。在試驗第33天(此時鵝已開產(chǎn)4d)將鵝每天的光照時間由11h增至16h,直到試驗結(jié)束。記錄每天的產(chǎn)蛋數(shù)(包括破損和軟殼蛋)和就巢情況,被確認就巢的母鵝進行人工強制終止就巢后重新歸群。以上2個試驗的血樣均用肝素鈉抗凝,3h內(nèi)離心分離血漿(2000g×20min,4℃),樣品保存于-20℃留待激素或抗體測定。鵝群的長短光控通過人工補光和遮光實現(xiàn),鵝群除光控需要限制在鵝舍外,其他時間可自由活動和采食。每天定時記錄各組產(chǎn)蛋數(shù),每3~4d檢查1次鵝群就巢情況,對母鵝的強制就巢通過隔離并限飼就巢母鵝7~10d實現(xiàn),然后重新歸群。1.2準確度、精密度和定量限血漿PRL和LH濃度的測定及其所用試劑均參考黃運茂等的方法。PRL放射免疫法的靈敏度為0.34ng·mL-1,標準曲線ED75、ED50和ED25分別為1.30、3.71和10.60ng·mL-1,LH放射免疫法的靈敏度為0.02ng·mL-1,兩者的批內(nèi)批間變異均小于15%,連續(xù)稀釋樣品所得抑制曲線與標準曲線平行。血漿P4用RIA藥盒(購于北方生物技術(shù)研究所)測定,測定方法在產(chǎn)品說明書的基礎上作適當改進,使標準曲線的精度范圍與正常動物激素水平范圍相一致;另外,為將類固醇激素結(jié)合蛋白的干擾降到最低,在測定中首先將血漿樣品在70℃水浴30min,以降解連接蛋白釋放出P4。測定方法的靈敏度、測定范圍和批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.2ng·mL-1、0.5~10ng和≤10%。血漿中INB濃度用ELISA試劑盒測定,測定方法按產(chǎn)品說明書進行操作。測定的靈敏度和范圍分別為1.0pg·mL-1和1.0~1000pg,批間批內(nèi)變異系數(shù)均≤10%。1.3測定的阻力水平鵝血漿抗體水平的測定及其所用試劑均參考黃運茂等的方法。1.4試驗2:產(chǎn)蛋率及血漿抗體水平試驗1:產(chǎn)蛋率為日產(chǎn)蛋率,日產(chǎn)蛋率(%)=日產(chǎn)蛋總數(shù)/當日母鵝產(chǎn)蛋總數(shù)(包括就巢鵝)×100%;就巢率為累計就巢率,累計就巢率(%)=累計(母)鵝就巢次數(shù)/累計總的(母)鵝就巢次數(shù)×100%。試驗2:產(chǎn)蛋率為累計產(chǎn)蛋率,累計產(chǎn)蛋率(%)=累計產(chǎn)蛋總數(shù)/累計總的(母)鵝產(chǎn)蛋次數(shù)×100%;就巢率為累計就巢率,計算同試驗1。對試驗1血漿各激素濃度變化和各產(chǎn)蛋期不同類型卵泡數(shù)變化及試驗2血漿抗體水平變化作單因子方差分析,對各時間點組間差異作t-檢驗;除注明外,各數(shù)值均用Mean±SE表示。所有的數(shù)據(jù)分析均用SASsoftwareversion8.01完成。2結(jié)果2.1試驗12.1.1兩組不能確定市售蛋白的期,開始出現(xiàn)就巢在第1~10天對就巢母鵝進行強制終止就巢后,鵝群于第24天恢復產(chǎn)蛋,第32天到達產(chǎn)蛋高峰,第36天開始出現(xiàn)就巢,并在第57天停產(chǎn)(圖1E)。鵝群產(chǎn)蛋高峰期共11d,產(chǎn)蛋率約40%(圖1E)。整個產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi),鵝群分別在產(chǎn)蛋高峰期(第40天)、停產(chǎn)期(第55天)和整個產(chǎn)蛋周期的累計產(chǎn)蛋依次為4.5、7.8和8.0枚。在鵝群完全停產(chǎn)后,整個鵝群的累計就巢率達90%(圖1E)。2.1.2不同產(chǎn)蛋期血漿lh和inb的變化在產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi),血漿PRL濃度在就巢時最高(約25ng·mL-1),隨著就巢的終止快速下降,開產(chǎn)前降至最低(約10ng·mL-1);在產(chǎn)蛋期,血漿PRL濃度慢慢上升,至鵝群產(chǎn)蛋由高峰即將下降時與就巢時的水平相當;產(chǎn)蛋高峰期后,PRL濃度在稍有下降后重新上升,在停產(chǎn)后上升至最高水平(圖1A)。血漿LH水平在整個周期內(nèi)呈現(xiàn)2次分泌波變化(圖1B)。隨著就巢的終止,LH水平上升,開產(chǎn)前升至最高水平(約2ng·mL-1);開產(chǎn)后,LH水平隨產(chǎn)蛋的增加慢慢下降,在產(chǎn)蛋高峰期下降至低水平(<1ng·mL-1);當產(chǎn)蛋開始下降時,LH濃度重新開始上升,但在產(chǎn)蛋即將結(jié)束時又再次快速下降,并在產(chǎn)后降至低水平(約1ng·mL-1),此時鵝群進入就巢期(圖1B)。整個周期內(nèi),血漿P4(圖1C)和INB(圖1D)的濃度均在就巢期和停產(chǎn)期最低(P4幾乎為0,INB約100pg·mL-1),在鵝群開產(chǎn)前慢慢上升,并在產(chǎn)蛋高峰期維持高水平(P4約1~2ng·mL-1,INB約250pg·mL-1);產(chǎn)蛋高峰期后,隨著產(chǎn)蛋的減少,兩者濃度快速下降,在停產(chǎn)期降至最低水平(圖1C和1D)。2.1.3不同產(chǎn)蛋期的lyf開產(chǎn)期和syf數(shù)量的變化就巢期卵巢上無SYF和LYF,SYF在就巢終止后開始出現(xiàn)((1.2±0.6)枚·只-1),在開產(chǎn)期數(shù)量最多((5.2±0.7)枚·只-1),在產(chǎn)蛋高峰期和停產(chǎn)期數(shù)量均較少((1.0±0.5)和(1.3±0.5)枚·只-1)(圖2)。LYF數(shù)在開產(chǎn)期最高((4.7±0.7)枚·只-1),隨著產(chǎn)蛋的繼續(xù),逐漸減少,產(chǎn)蛋高峰期和停產(chǎn)期分別為(3.7±0.7)和(1.8±0.8)枚·只-1(圖2)。開產(chǎn)前卵巢LYF和SYF的總數(shù)為約10枚,產(chǎn)蛋高峰期卵巢LYF(3.7枚)、SYF(1.0枚)數(shù)和產(chǎn)蛋數(shù)(4.5枚)之和接近10枚,鵝停產(chǎn)后平均產(chǎn)蛋數(shù)(8.0枚)與卵巢LYF(1.8枚)和SYF(1.3枚)數(shù)之和約11枚(圖2)。另外,整個周期內(nèi)LWF數(shù)無明顯差異,但就巢終止后和停產(chǎn)期的LWF數(shù)高于其它各階段(圖2)。這些數(shù)據(jù)提示,在產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi),母鵝終止就巢后卵巢上有約10枚LWF能進入等級發(fā)育階段,其中的8枚在產(chǎn)蛋期產(chǎn)出,2或3枚閉鎖退化,同時產(chǎn)蛋期間無LWF進入等級發(fā)育階段。2.2試驗22.2.1抗體檢測結(jié)果血漿抗體水平直接用OD值表示(圖3A)。在首次免疫前,免疫組和對照組的OD值均很低,未檢測到抗體;首次免疫后,免疫組抗體水平快速上升,并在15d后顯著高于對照組(P<0.01),而對照組仍未檢測到抗體。在第2和3次加強免疫后,免疫組抗體水平持續(xù)上升,并在第3次免疫后在整個試驗期維持在高水平,而對照組依然未檢測到抗體(圖3A)。2.2.2血清蛋白的產(chǎn)蛋運動2組鵝群均在第29天開產(chǎn),于第60天停產(chǎn)。免疫組產(chǎn)蛋率上升較慢(P<0.05),產(chǎn)蛋高峰期到來較遲(圖3B)。在產(chǎn)蛋的前半期,對照組累計產(chǎn)蛋率高于免疫組,在后半期則相反(圖3C)。2組均在第42天開始出現(xiàn)母鵝就巢;在就巢發(fā)生的前期,對照組累計就巢率高于免疫組,后期免疫組累計就巢率快速上升,逐漸與對照組相當;在第62天對照組和免疫組的累計就巢率分別為94.3%和97.3%(圖3D)。整個試驗期(即鵝的一個完整產(chǎn)蛋周期),對照組和免疫組平均每只母鵝產(chǎn)蛋7.0和8.0枚,后者比前者多1.0枚,即免疫PRL使一個周期的產(chǎn)蛋增加1枚。產(chǎn)蛋期2組鵝的羽毛沒有區(qū)別;鵝群停產(chǎn)后約1周,對照組開始換羽,免疫組換羽比對照組晚約1周。3prl的上升和抑制試驗1提示,在馬崗鵝產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi)的卵泡發(fā)育過程中,PRL和LH發(fā)揮重要調(diào)控作用,這與在雞、鴨和四季鵝上的研究結(jié)果相一致。在馬崗鵝產(chǎn)蛋-就巢的周期性變化中,血漿PRL水平在就巢期最高,產(chǎn)蛋期較低,其隨著就巢終止快速下降,隨著就巢發(fā)生快速上升,與通常認為PRL是禽類就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵激素理論相一致。血漿LH濃度與PRL呈現(xiàn)相反變化,其濃度隨著就巢終止快速上升,隨著就巢發(fā)生快速下降,與在雞和火雞上的研究結(jié)果相同。其原因是PRL通過下丘腦GnRH抑制FSH和LH分泌。PRL下降和LH上升利于卵泡發(fā)育,使鵝群在第24天恢復產(chǎn)蛋。卵泡發(fā)育過程分泌的大量雌二醇、P4和INB導致在開產(chǎn)期P4和INB水平快速上升,并且在產(chǎn)蛋期維持高水平,而在產(chǎn)蛋后期隨著產(chǎn)蛋一起快速下降,到停產(chǎn)期降至最低,這些變化趨勢與LH相一致,與在家雞和四季鵝上的結(jié)果相似。產(chǎn)蛋期卵泡發(fā)育所分泌的雌二醇和P4也將促進垂體分泌PRL,使產(chǎn)蛋期PRL水平上升,在后期隨著產(chǎn)蛋的下降有所降低,但之后由于就巢的增多又重新上升,直至鵝群停產(chǎn)。在整個產(chǎn)蛋-就巢周期,LH水平呈現(xiàn)2個分泌波,前一個是由于就巢的終止和PRL的下降,后一個可能是由于同期PRL水平的暫時下降引起。與激素變化相一致,就巢期馬崗鵝卵巢萎縮,無任何卵泡。隨著就巢終止,卵泡發(fā)育,在開產(chǎn)前卵巢上有4.7枚·只-1的SYF和5.2枚·只-1的LYF。恢復產(chǎn)蛋后,在產(chǎn)蛋高峰期,母鵝產(chǎn)蛋數(shù)(4.5枚·只-1)和卵巢LYF(3.7枚·只-1)、SYF(1.0枚·只-1)數(shù)之和與開產(chǎn)前LYF和SYF數(shù)之和(9.9枚)相當,而此階段的母鵝產(chǎn)蛋數(shù)與LYF數(shù)之和(8.2枚)與整個產(chǎn)蛋-就巢周期內(nèi)的母鵝產(chǎn)蛋數(shù)(8.0枚)接近。這些提示,在產(chǎn)蛋前半期,隨著LYF形成蛋產(chǎn)出,不斷有SYF發(fā)育為LYF或閉鎖,而在產(chǎn)蛋高峰后SYF不再發(fā)育為LYF,其中原因可能是PRL上升和INB分泌造成;同時還提示,開產(chǎn)后要么無LWF發(fā)育為SYF,要么在LWF發(fā)育為SYF的同時有相應數(shù)量的SYF閉鎖。另外,產(chǎn)蛋高峰后的LWF數(shù)均高于開產(chǎn)期,這提示在產(chǎn)蛋期不斷有新LWF生成,但不大可能發(fā)育為SYF。一般認為,通過免疫PRL與其釋放因子VIP,或使用促VIP分泌的多巴胺和5-羥色胺的受體拮抗劑可抑制就巢并提高產(chǎn)蛋。試驗2提示,免疫PRL雖有時可一定程度提高產(chǎn)蛋,但低水平的PRL可能是禽類卵泡發(fā)育所必需的。試驗2的整個試驗期為一個完整的產(chǎn)蛋-就巢周期。在整個試驗期,免疫組和對照組的累計產(chǎn)蛋為8.02和7.01枚·只-1,前者比后者多產(chǎn)1.01枚。與試驗1中一個完整的產(chǎn)蛋-就巢周期產(chǎn)蛋約8枚·只-1相比,試驗2對照組卻少產(chǎn)蛋1枚·只-1,免疫組則相當。這可能是由于試驗2在鵝群開產(chǎn)3d后將每天光照時間由11h延長至16h所致。研究表明,對馬崗鵝延長光照可以促進PRL分泌并抑制產(chǎn)蛋。因此,在對照組PRL上升會抑制卵泡發(fā)育,促進母鵝就巢和停產(chǎn),使產(chǎn)蛋數(shù)比正常情況下(即試驗1短光照)少;而對于免疫