穗花杉組培快繁技術研究

根據劉克旺和孫同興的研究，綏化山紅杉是第三系殘留植物，雌性和少雄性。果實量小，不穩定，分為大、小、小的不同年份。種子期長，幼苗容易干燥，整個植物死亡。高繁育效率低。根據嚴格的棲息地條件和嚴重的人為破壞，我們研究了綏化山的有效繁殖方法。如果我們能通過小規模的修剪來生長綏化山，有效的快速栽培，對于保護珍稀穗花杉的群落非常重要。從1998年10月到2001年3月，將桿段作為室外植物進行了無菌組織培訓試驗，并取得了初步成效。1材料和方法1.1材料表面從保護區移入苗圃的穗花杉實生苗,取莖段進行組織培養;當年發芽苗,取嫩莖試驗.1.2方法1.2.1帶節莖段作外植體接種4月下旬～11月上旬,采集嫩枝,自來水及洗滌液處理過后,切分成約0.8～1cm的帶節莖段作外植體接種.因紅豆杉科植物組培污染和褐化是大問題,試驗采用了KMnO4、70%酒精、0.1%升汞3種藥品不同處理時間共9組合進行正交試驗,對莖段進行綜合消毒處理.每組20瓶培養基進行比較試驗,培養30d后記載污染數、褐化數、存活數.1.2.2水株或6-baba、kt、u3000添加不同濃度的激素基本培養基有1/2MS和MB共2種,添加蔗糖前者為2.5g/100g,后者為2.0g/100g,瓊脂0.8g/100g,pH值5.8,活性炭0.3g/100g,并附加不同濃度的激素,如NAA、6-BA(BA)、ZT、KT、IBA等.128℃高溫蒸氣滅菌15min.1.2.3誘導誘導試驗培養基為1/2MS(基)+蔗糖2.5g/100g+瓊脂0.8g/100g+活性炭0.3g/100g+BA3mg/L+NAA2mg/L,依不同溫度(21、25℃)及光照(明、暗)情況分4組交叉試驗.30d后觀察愈傷組織誘導情況,50d后觀察腋芽誘導情況.1.2.4激素配比對高校說利用中南林學院重點實驗室的設備進行穗花杉莖段腋芽的誘導,每瓶培養基接1個莖段,溫度(25±1)℃,光照人為控制進行對照實驗.采用帶節莖段,經不同激素配比的組合實驗,1～2次轉接后,誘導腋芽萌發.基本培養基有兩種:一種為MB,附加激素NAA4水平和KT3水平,采用全面試驗法;另一種為1/2MS,附加活性炭,NAA、BA、KT3激素3水平采用正交試驗法,進行腋芽誘導試驗.1.2.5試苗帶節莖段培養誘導出的腋芽苗轉入壯苗培養基,一部分待苗長至2cm長以后,切取試管苗帶節莖段,循環取材再培養,誘導腋芽,一部分則誘導不定根.采用1/2MS基本培養基,3種配方:壯1加NAA0.1mg/L;壯2加IBA0.1mg/L;壯3為基本培養基.記錄發葉數和莖的長度.1.2.6植物激素的誘導待壯苗培養基中的苗長至8片葉以上,若高度不及2cm,莖較粗,基部有大團愈傷組織,即可轉移到含不同植物激素IBA、NAA、KT、ZT的1/4MS培養基(MS大量元素減為1/4,其它減為1/2),附加蔗糖2.0%、瓊脂0.8%、pH值5.8,誘導不定根.2結果與分析2.1污染情況對土壤污染率的影響處理30d后,20瓶中有部分外植體污染,沒有污染的也有部分褐化,存活下來的一部分產生愈傷組織,一部分基本無變化,一部分節上膨大,可望產生腋芽.具體處理方法及結果見表1.從表1可知,控制污染效果較好的有組合2(KMnO40.1%處理5min+70%酒精處理0.5min+0.1%升汞處理10min)和組合5(KMnO40.1%處理8min+70%酒精處理30s+0.1%升汞處理15min),污染率皆為30%,但后者褐化較嚴重;防止褐化效果最好的有組合1(KMnO40.1%處理5min+70%酒精處理0.1min+0.1%升汞處理5min),但是污染率較高;綜合污染數和褐化數分析存活率,材料最佳處理方法為組合2,外植體存活率為40%.2.2對愈傷組織和腋芽的誘導效果不同溫度及光照培養30d愈傷組織情況、50d腋芽誘導情況見表2.從表2可知,不同溫度(21、25℃)對愈傷組織和腋芽的誘導效果有差異,其中21℃對于莖段愈傷組織的發生率更高些,而25℃下培養有利于誘導腋芽發生;光照下愈傷組織略比暗培養下易發生,但對腋芽誘導沒有明顯影響.故在穗花杉組織培養中重點要注意溫度,光照可以不用考慮.2.3腋芽誘導試驗在芽的誘導過程中成功分化了腋芽.組別1～12采用MB基本培養基,附加不同激素;組別13～21采用1/2MS基本培養基,附加不同激素,進行腋芽誘導試驗,結果見表3、圖1.表3中組合22～25表明,僅用生長素和細胞分裂素單獨進行誘導都是難以成功的;組合1～12說明,腋芽誘導以MB基本培養基+NAA0.5mg/L+KT1.5mg/L為最適,成功率為60%(第6組);1/2MS基本培養基+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L+活性炭0.3%(第18組)效果也較好,腋芽誘導率為50%.2.4激素對乳苗中、苗莖生長的影響腋芽初步誘導出來后,似綠豆大小突起,在原培養基上生長緩慢,故轉至壯苗培養基,促進腋芽生長,利于生根.進行此項試驗時,共有無污染腋芽84瓶,每組合都試驗28瓶,每瓶23～24mL.培養結果見表4.從表4可知,附加激素IBA0.1mg/L的壯苗培養基壯2上生長的試管苗發葉最多,而不加任何激素的培養基壯3上生長的試管苗莖伸長最多.若想擴大繁殖系數,循環取材,可將腋芽苗轉接入不加激素的培養基中促其莖伸長,長至2cm以后,可切除上半部約1cm莖段轉接到腋芽誘導培養基中,使之芽生芽或“以芽還芽”;若直接促其生根,則先將其轉入附加IBA0.1mg/L的壯苗培養基壯2上促進發葉、強壯,而后轉入生根培養基.2.5穗花杉試管苗的生根共28瓶,轉入生根培養基.添加激素IBA、NAA、KT、ZT.結果見表5、圖2.從表5可知,穗花杉試管苗在適當的生長素配比下(IBA4mg/L+NAA2mg/L)可以生根,而且根生長良好,培養基中不宜加入分裂素.實驗中,根是在愈傷組織團上形成,屬于不定根.這是裸子植物組織培養上的一項成果,也是珍稀保護植物種質資源保存的一項成果.3誘導腋芽發生(1)腋芽分化的最適培養基為MB(1/2MS+B5)+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖2.0%+瓊脂0.8%,腋芽誘導率可達60%.培養基1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L+活性炭0.3%+蔗糖2.5%+瓊脂0.8%效果也不錯,腋芽發生率可達50%.(2)最適試管苗發葉壯苗培養基為1/2MS+IBA0.1mg/L+瓊脂0.8%+蔗糖2.0%.不加任何激素的1/2MS培養基上生長的試管苗莖伸長最多.若要誘導生根,可采用前者;若想循環取材繁殖,可以采用后者.(3)成功誘導不定根的培養基為1/4MS+IBA4mg/L+NAA2mg/L+瓊脂0.8%+蔗糖2.0%.(4)材料最佳處理組合為KMnO40.1%處理5min+70%酒精處理0.5min+0.1%升汞處理10min.在2