黃芪丹參有效組分不同比例配伍對腎纖維化大鼠腎小管上皮細胞轉分化的影響

腎微細胞上皮間質化（pmt）對腎纖維機化起著非常重要的作用。各種慢性腎臟病發展過程中,由于腎小管上皮細胞向成纖維細胞和成肌纖維細胞的表型轉化,導致細胞外基質異常增多,從而加重腎小球硬化和腎小管間質纖維化的進程。黃芪丹參藥對是臨床應用治療腎纖維化最常用的兩味藥物,兩味藥物配伍防治腎纖維化的實驗研究目前還很少見,未發現其有效組分不同劑量配伍干預腎纖維化大鼠腎小管上皮細胞轉分化的相關實驗研究。本實驗在于研究并揭示黃芪丹參藥對有效組分不同劑量配伍對腎小管上皮細胞轉分化過程的抑制作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1daw高效實驗大鼠sd清潔級(SPF級)、健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠,由廣東省醫學實驗動物中心提供,體質量180~220g。動物許可證編號:SCKK-(粵)2008-0002。1.1.2關于sf-hq、sfds黃芪總皂苷、丹參總酚酸,陜西省森弗生物技術有限公司提供(批號分別為SF-HQ100427、SFDS100430);福辛普利,中美上海施貴寶制藥有限公司提供(批號為1001091)。1.1.3大鼠-sma檢測SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木素,福州邁新公司提供。兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體,北京博奧森生物科技有限公司提供。兔抗大鼠E-cadherin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗、抗體稀釋液,武漢博士德公司提供。1.1.4材料和硬件條件TB-718D生物組織自動包埋機、TK-218Ⅲ型恒溫推片烤片機,湖北泰維醫療科技有限責任公司;ZT-12H生物組織自動脫水機,湖北孝感亞光用電子技術研究所;臺式高速冷凍離心機(5810型),Eppendorf,德國;HPIAS-1000彩色圖像分析系統,武漢同濟醫科大學千屏影像公司。1.2方法1.2.1大鼠的固定術根據文獻方法建立大鼠腎纖維化模型。以3%戊巴比妥鈉(2ml/kg)腹腔注射麻醉,麻醉成功后,固定大鼠,備皮,消毒,鋪巾。在距脊柱約1~1.5cm,肋緣下做長約1~1.5cm縱行切口,逐層剝離皮下筋膜,切開肌肉,暴露出腎盂,找到右輸尿管,將大鼠改左側臥位,玻璃分針分離輸尿管,取中段結扎,逐層縫合,關閉腹腔,再次消毒切口,無菌敷料覆蓋包扎。1.2.2給藥、藥-藥大鼠適應性喂養1周,隨機分為正常組(n=8)和造模組(n=48)。造模后隨機分為5組,分別為模型組(n=8)、黃芪丹參藥對有效組分配伍1∶1組(n=10)、黃芪丹參藥對有效組分配伍1∶2組(n=10)、黃芪丹參藥對有效組分配伍2∶1組(n=10)及福辛普利組(n=10),第二天開始給藥。藥物用0.9%NaCl溶液配置成相應濃度,給藥體積為10ml/kg,共灌胃14d。其中黃芪丹參藥對有效組分配伍1∶1組(簡稱組分配伍1∶1組),每毫升含3.75mg黃芪總皂苷和4mg丹參總酚酸;黃芪丹參藥對有效組分配伍1∶2組(簡稱組分配伍1∶2組),每毫升含3.75mg黃芪總皂苷和8mg丹參總酚酸;黃芪丹參藥對有效組分配伍2∶1組(簡稱組分配伍2∶1組,每毫升含7.5mg黃芪總皂苷和4.0mg丹參總酚酸、福辛普利組(每毫升含0.66mg);模型組給予自由進食和等量蒸餾水灌胃。灌胃第14天后,在麻醉狀態下,剖開動物腹腔,剝離全部腸組織,腹主動脈采血后取結扎側腎臟,從中間分為兩部分,1/2部分置于液氮中保存,1/2部分置于4%多聚甲醛中固定。取多聚甲醛固定組織塊進行乙醇脫水、石蠟包埋后制成4μm石蠟切片,分別進行HE和免疫組織染色。1.2.3免疫組化檢測腎組織e-cadhenin、-sma表達(1)腎組織病理:常規HE染色,鏡下觀察腎臟病變。腎小管間質損傷評分:采用Oikawa法半定量腎小管間質纖維化的程度,并根據程度評分,即0:正常或<25%,評0分;+:病變面積為25%~50%,評1分;++:50%~75%,評2分;+++:>75%,評3分。(2)腎功能:血漿尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)測定,均采用全自動生化分析儀測定。(3)免疫組織化學檢測腎組織E-cadherin、α-SMA表達:采用SP法,E-cadherin為即用型,α-SMA為1∶50稀釋,嚴格按照免疫組化過程進行操作。(4)α-SMA、E-cadherin灰度值:免疫組化陽性結果為細胞質及腎間質染成棕黃色或黃色顆粒,采用HPIAS-1000計算機圖像自動分析系統對各組圖像進行分析,每張切片在400倍視野下隨機取5個視野,計算每個視野的平均灰度級,分為0~255級共256級,平均灰度值越高,表明其透光率越強,免疫組化染色越淺,陽性率越低。1.2.4多組數據統計分析采用SPSS13.0統計軟件分析所得數據。各組數據以表示,多組資料間比較采用單因素方差分析,LSD法與Tamhane’sT2檢驗比較組間差異。以P<0.05為判斷差異具有統計學意義。2結果2.1各組大鼠腎功能損害情況比較與正常組比較,其余各組Scr水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),而BUN水平差異無統計學意義(P>0.05),說明造模大鼠出現腎功能損害。與模型組比較,福辛普利組Scr水平降低,差異有統計學意義(P<0.05);其余各治療組Scr水平差異無統計學意義。與福辛普利組比較,各組分配伍組Scr水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);BUN水平差異無統計學意義(P>0.05)。各組分配伍組之間比較Scr、BUN水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。2.2各組大鼠病理改變2.2.1各組大鼠評分比較與正常組比較,其余各組評分值均升高,差異有統計學意義(P<0.05),說明造模大鼠腎組織病理損害嚴重。與模型組比較,福辛普利組評分值降低,差異有統計學意義(P<0.05);其余各治療組評分值差異無統計學意義。與福辛普利組比較,各組分配伍組HE評分升高,差異有統計學意義(P<0.05)。各組分配伍組之間比較無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖1。2.2.2各組大鼠腎組織e-cadhenin表達比較,見表1E-cadherin表達:正常組腎組織E-cadherin呈強陽性表達,模型組呈弱陽性表達,而各治療組腎組織E-cadherin陽性表達不同程度增強。見圖2。E-cadherin半定量分析結果:與正常組比較,其余各組腎組織E-cadherin灰度值水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),說明造模大鼠腎組織E-cadherin陽性表達減少;與模型組比較,各治療組E-cadherin表達灰度值水平有不同程度降低,差異有統計學意義(P<0.05),說明各治療組大鼠腎組織E-cadherin陽性表達不同程度增強;組分1∶1組與福辛普利組比較,差異無統計學意義(P>0.05);組分配伍1∶2組及組分配伍2∶1組E-cadherin表達灰度值水平明顯高于福辛普利組(P<0.05),說明福辛普利組和組分1∶1配伍組均具有增強模型組腎組織E-cadherin陽性表達作用,且療效優于組分配伍1∶2組及組分配伍2∶1組。見表3。α-SMA表達:正常組、福辛普利組腎組織α-SMA灰度值水平較高,表明在腎小血管壁或腎間質細胞α-SMA有少量表達。模型組α-SMA表達主要存在于腎間質細胞及小血管壁,并隨著腎纖維化的逐漸加重,腎間質細胞的增生,α-SMA灰度值水平降低,呈強陽性表達。組分配伍1∶1組、福辛普利組,α-SMA的表達灰度值明顯升高,陽性表達明顯降低,其陽性表達受到明顯抑制,其余各治療組對模型大鼠腎組織α-SMA表達有不同程度抑制作用。見圖3。α-SMA半定量分析結果:與正常組比較,模型組及組分配伍2∶1組腎組織α-SMA灰度值水平降低,陽性表達增強,差異有統計學意義(P<0.05),說明造模大鼠α-SMA表達增多。福辛普利組、組分配伍1∶1組腎組織α-SMA表達灰度值水平明顯高于模型組(P<0.05)。組分配伍1∶2組、組分配伍2∶1組腎組織α-SMA表達與模型組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。說明福辛普利組、組分配伍1∶1組具有抑制腎組織α-SMA表達作用,而且效果相當,而組分組分配伍1∶2組、組分配伍2∶1組抑制腎組織α-SMA表達作用不明顯。見表3。3不同藥物配伍的干預uui大鼠肝腎t-crc-mfd的作用早期干預腎纖維化對防治終末期腎病發生,提高患者生活質量,具有重要意義。隨著西醫防治慢性腎臟病進展日漸深入,發現引起腎纖維化發生的分子機制EMT主要與TGF-β/Smad、Jak/Stat、Wnt/β-catenin等多條信號通路有關,抑制EMT發生,成為治療慢性腎病的關鍵。在高糖、蛋白尿、腎毒性藥物、尿毒素血清、移植腎腎病等導致腎纖維化發生的研究均涉及EMT的發生。EMT發生主要過程是腎小管上皮細胞E-cadherin表達下降,向成纖維細胞發生轉化,成纖維細胞獲得平滑肌細胞的某些表型,成為肌成纖維細胞,其標志物α-SMA表達增加。肌成纖維細胞產生并分泌大量細胞質基質,細胞質基質的過度積累而導致腎纖維化加重。近年來,中醫藥通過抑制腎纖維化過程中EMT發生的研究較多,主要采用中藥單體、經典方劑、經驗復方制劑等進行實驗研究。在腎內科,黃芪注射液與丹參注射液經常單獨或聯合應用治療慢性腎臟病而防治腎纖維化的發生發展,但未見黃芪丹參有效組分不同比例配伍干預UUO大鼠腎小管上皮細胞轉分化的作用的相關研究。僅見趙建榮等采用黃芪當歸合劑,樸勝華等采用黃芪、三七不同劑量配伍的通脈口服液進行腎纖維化治療的相關研究。黃芪丹參配伍能夠針對腎纖維化病機脾腎氣虛、瘀血阻絡而發揮補氣活血之功效。本研究證實:黃芪