蒙醫灸療對大鼠海馬衰老因子的影響

隨著人口老齡化水平的提高，抗衰老是醫學領域的研究主題之一。它也是提高生活效率、改善人類體質、適應重要器官功能、恢復身體環境平衡的基本要求。本研究依據蒙醫文獻記載,篩選了抗衰老特異性較強的頂會、火衰、胃、腎等4個穴位,通過C43灸療方法探討所選穴位之間的協同和拮抗作用。儀器、試劑與儀器選取3月齡健康SD大鼠60只,體質量(180±20)g,雌雄各半,購自北京大學醫學部,合格證號:SCXK(京)2009-2011。所有大鼠均用標準飼料喂養,自由進水;飼養環境溫度(22±2)℃,相對濕度50%-55%,人工控制室內照明,保持12h光照(8:00-20:00)黑暗(20:00-次日8:00)交替循環。UV-365型分光光度計(日本產)、隔水電熱恒溫培養箱PYX-DHS(上海市躍進農場醫療器械廠)、分析天平(上海精密科學儀器有限公司)、高速冷凍離心機(上海將來實驗設備有限公司)、(4-20)℃或-80℃冰箱(美國產)、WELLWASH4MK2型酶標儀(芬蘭產)、Morris水迷宮儀(上海欣軟信息科技有限公司)。D-半乳糖,批號:20110614;乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)試劑盒,批號:20110721;多巴胺(dopamine,DA)試劑盒,批號:20110716;單胺氧化酶(monoamineoxidase,MAO)試劑盒,批號:20110720,均由南京建成生物工程研究所提供。組織病理學檢查將SD大鼠適應性喂養1周后隨機分成正常組(Z組),模型組(M組),頂會、火衰、胃穴組(A組),頂會、胃、腎穴組(B組),火衰、胃、腎穴組(C組)和頂會、火衰、腎穴組(D組),每組10只。Z組不造模、不施灸,連續42d頸背部皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液;M組和灸療組均用5%D-半乳糖150mg/kg頸背部皮下每天注射1次。在造模期間,每周稱大鼠體質量1次,并觀察外部特征,如皮毛顏色、駝背、活動情況、怕冷、進食情況等。頂會穴:位于從兩眉正中,往上劃一線,再從兩耳葉上緣正中往上劃一線,此二線在頭頂之交叉處。火衰穴:位于劍突尖直下2寸處及左右各1寸處,并列三穴。胃穴:位于第十二脊椎下凹正中處,從此點再向左右量1寸處各有一穴,并列三穴。腎穴:位于第十四脊椎下凹正中和再向左右量1寸各有一穴,三口并列。對Z和M組大鼠做固定處理,而對其他組從第7周開始施灸。參照文獻方法,對灸療組選定穴位,剪毛后施灸,涂凡士林以保護大鼠皮膚且便于固定艾炷。艾炷直徑3mm、長1cm、灸墊厚度0.5mm,每次共施灸15min,1次/隔日,共灸21次。(1)定位航行試驗:水溫25℃左右,每日上、下午各4次,將大鼠面向池壁分4個象限放入水中,記錄其在120s內尋找到平臺的時間記為逃避潛伏期。如果大鼠在120s內未找到平臺,則用手牽引其至平臺上,讓大鼠停留10s,再放回籠中,并記潛伏期為120s,歷時5d。(2)空間探索實驗:第6天撤除平臺,任選一個入水點將大鼠放入,記錄其120s內跨越原平臺位置的次數。斷頭后在冰面上快速取出雙側海馬,用0.9%氯化鈉溶液沖洗,濾紙拭干,稱重。將海馬置于5mL玻璃勻漿器中,加入預冷的0.9%氯化鈉溶液(按1:9重量比),并把管下部插入盛有冰塊的容器中,充分研磨使組織勻漿化(約5-6min),制成10%的勻漿。勻漿4000r/min離心15min,取上清液置于干凈試管內備用。取出海馬后,立即取脾臟和胸腺,用0.9%氯化鈉溶液洗凈并稱重。計算脾臟(胸腺)指數的公式為:脾臟(胸腺)指數=脾臟(胸腺)重量(mg)/體質量(g)。采用高效液相色譜加電化學(HPLC-ECD)方法測定DA含量;采用高效液相-柱后衍生化-電化學檢測器(HPLC-RE-ECD)方法測定Ach含量;采用(比色法)方法測定MAO含量。DA比色波長為450nm,Ach為550nm,MAO為242nm。實驗數據統計采用SPSS17.0軟件處理。數據以表示,各組之間的比較采用q檢驗進行統計學分析。以P<0.05為差異有統計學意義。穴組不同配伍組da、ach和mao含量比較見表1。結果顯示,造模后M組體質量增加變緩,與Z組比較,M組顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。三穴組灸療以后,除D組外其他配伍組的DA和Ach含量均明顯高于M組(P<0.01)。見表3。三穴組灸療以后,除D組外其他配伍組的MAO含量均明顯低于M組(P<0.01)。見表4。灸療以后,除D組外其他灸療組的脾臟、胸腺指數明顯高于M組(P<0.05)。見表5。灸療以后,除D組外其他灸療組的學習和記憶力明顯提高于M組(P<0.01,P<0.05)。穴位配伍的病理變化我國歷代醫家對衰老及養生有著豐富的理論和實踐,認為陽氣失常、陰氣虛衰以及五臟氣血虧虛為衰老主因,將灸療用作養生保健和延緩衰老的重要手段。馬良宵等研究發現,保健經穴對機體具有多方面、多環節、多水平的調整作用,能提高機體免疫力,從而達到良性調整、防病、抗衰老的作用。韋良玉等認為,可通過艾炷灸提高腦組織總SOD的活力從而提高學習記憶力,延緩腦組織老化。許煥芳等研究認為隨年齡增長,免疫器官開始老化,免疫細胞及細胞因子逐漸發生改變,從而導致衰老發生。灸療作用的實質為調整人體陰陽平衡,糾正其偏盛偏衰的病理現象,使亢者平,弱者強,恢復正常的機能狀態;而蒙醫理論認為,人體依賴赫依、希拉、巴達干動態平衡而維持生命運動,且三根(赫依、希拉、巴達干)之間的互相依存、制約使人體功能得以正常運轉。造模后大鼠體質量變化及動作變遲緩、毛色枯黃、精神萎靡等外部特征與文獻報道的衰老模型一致,表明本實驗造模成功。已有研究表明,胸腺能夠分泌多種細胞因子,促進T淋巴細胞成熟,對機體的免疫功能發揮重要作用;而脾臟是機體最大的免疫器官,含有大量的淋巴細胞和巨嗜細胞,是機體細胞免疫和體液免疫的中心。如表4所示,灸療組(除D組)的脾臟、胸腺指數均明顯高于模型組,表明可有效增強體質并提高機體的免疫功能。研究顯示,在正常情況下大腦中的單胺類神經遞質含量保持在一定水平;而出現衰老時,由于降解的單胺氧化酶的含量急劇增高,神經組織中的DA和Ach過量降解,含量下降,導致神經和內分泌功能衰變。由表2-表3可知,通過所選三穴組進行配伍灸療可有效抑制單胺氧化酶的活性,延緩神經遞質的降解,從而達到機體抗衰老作用,同時也對學習和記憶等腦的認識功能起重要作用。上述結果有效驗證了蒙醫文獻記載的頂會、火衰、胃、腎等四穴位的抗衰老作用。需要指出的是,配伍時單穴抗衰老作用相抵消或不同穴位的作用途徑并非相同,本實驗中灸療D組提示了臨床上可能的配伍禁忌。類似結果在已有文獻中略有報道,如張京晶等發現,穴性相同或有協同作用的穴位配伍使用可提高療效,而穴性相反或有拮抗作用的穴位配伍,則不僅降低療效,還可能會適得其反。本研究中,首次采用SD大鼠,觀察蒙醫配伍灸療法對機體的抗衰老作用。SD大鼠與Wista鼠相比,生長發育快,對疾病的抵抗力較強,更適合于在抗衰老研究中做模型大鼠。另外,為觀察蒙醫灸療中穴位之間的協同和拮抗作用,本研究首次通過三穴組灸療,測定了DA、Ach、MAO等含量。與以往研究相比,采用更合理的配伍組合,所測指標也能較全面地反映對抗衰老作用的影響。人體的衰老機制非常復雜,而蒙醫灸療法可以多種途徑達到抗衰老作用。目前蒙醫配伍灸療的抗衰老作用研究還處在初始階段,后續研究中應培育更成熟的模型大鼠、