膠原海綿的生物相容性和降解

0凝血酶抑制劑的應用蛋白質是細胞外基質的主要成分，相對分子量約為300萬噸。它是所含的最廣泛的功能蛋白質，占蛋白質總數的25.30%。膠原作為一種纖維狀蛋白,自身即為優良的組織工程支架材料,是最早被利用的生物材料之一,擁有特殊的三股肽鏈螺旋結構,具有可降解性、生物相容性和止血性等許多優良的生物學特性,近些年在創面修復領域得到了廣泛應用,并形成多種產品形式。其中膠原蛋白海綿是由膠原溶液經凍干形成,是基于膠原生物材料的一種主要產品形式,已被廣泛應用于各種創面止血,組織殘腔的填充修復。張安美將凝血酶與膠原蛋白海綿聯合用于手術創面,發現其有較好的止血作用和安全性。另外,也有很多報道將人肌腱、牛肌腱、鼠尾、豬皮等制備的膠原蛋白海綿用于臨床治療,其良好的功能和特性,以及易于加工、滅菌和保存等獨特優勢,被視為非常有前景的生物材料之一,具有廣泛的科研和臨床應用價值。張立彥等通過考察形貌及理化特征優化了殼聚糖/膠原蛋白復合海綿性能,使其抗張強度為85MPa、斷裂伸長率為4.87%、吸水率為200%、孔隙率為78.8%,采用掃描電鏡檢測復合海綿孔徑大小為100-150μm。王秋卓以牛跟腱為原材料,分析了海綿狀膠原蛋白纖維均勻度、抗原性、色澤及纖維細度等性狀,并觀察了產品的純度和膠原纖維結構。汪海嬰等采用差式掃描量熱儀、體外模擬膠原蛋白酶降解、材料拉伸性能分析及NIH/3T3細胞培養實驗評價了魚皮酸溶性膠原海綿,魚皮酶溶性膠原海綿和豬皮酶溶性膠原海綿的材料熱穩定性、降解性、生物相容性和材料機械力學性能。對生物材料相容性研究有很多方法,其中常用的有體內直接植入法和體外復合細胞培養法兩種。馬忠仁等將新生牛皮膠原蛋白海綿與黑裘皮羔羊腎成纖維細胞共培養,發現海綿具有良好的生物相容性。方成等將魚皮酸溶性膠原蛋白、魚皮酶溶性膠原蛋白、豬皮酶溶性膠原蛋白植入SD大鼠,評價細胞附著、免疫原性及致炎性等,結果表明魚皮酶溶性膠原海綿具有組織相容性優勢。Ueda等利用膠原海綿結合轉化生長因子β1植入促進兔顱骨缺損骨修復,結果顯示海綿表現出良好的生物相容性和促修復作用。本實驗選擇牛源膠原蛋白海綿為研究對象,評價其微觀結構、變性溫度、降解性能、生物相容性等生物性能,評估牛源活性膠原蛋白海綿在生物醫學領域的應用價值。1膠原蛋白海綿的檢測設計:材料特性及動物實驗觀察。時間及地點:實驗于2012年4至7月在暨南大學和廣州中醫藥大學實驗動物中心完成。材料:實驗動物:11至12周齡普通級新西蘭兔24只,雌雄不拘,體質量1.8-2.2kg,由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供,實驗動物合格證號:0104935,動物實驗環境設施合格證號:0062307。藥物及試劑:膠原蛋白海綿(廣州創爾生物技術股份有限公司,批號20110404);水合氯醛(上海化學試劑采購供應五聯化工廠,批號:20050620);安爾碘(上海利康消毒高科技有限公司,批號:20120216)。實驗方法:膠原蛋白海綿的形貌與熱穩定性研究:掃描電鏡分析膠原蛋白海綿的形貌:通過掃描電鏡觀察膠原蛋白海綿的孔徑及纖維結構。用D-Hank’s液小心洗滌樣品,以2%戊二醛和1%鋨酸4℃固定,乙醇梯度脫水,臨界點干燥,離子濺射儀噴金,掃描電鏡觀察。透射電鏡分析膠原的微觀結構:取一定量的膠原蛋白海綿,溶于0.1mol/L醋酸溶液,配制成膠原溶液,取少許膠原溶液,采用負染法制備電鏡樣品,pH7.4條件下的1%磷鎢酸染色1min,自然風干,于PhilipsTecnai10透射電鏡下觀察其形態。圓二色譜分析膠原的二級結構及熱穩定性:準確稱取一定量膠原蛋白海綿,溶于0.1mol/L醋酸溶液,配制成質量濃度為0.5g/L的蛋白溶液。將溶液樣品加入1mm光徑的石英池,在180-260nm波長范圍內進行掃描,記錄結果為3次掃描的平均值。以凍干成海綿前的膠原溶液作為對照組。變溫掃描選取[θ]220nm處進行,取膠原溶液、膠原蛋白海綿配置的蛋白溶液樣品分別加入1mm光徑的石英池,溫度區間設置為15-60℃,升溫速率為1℃/min。植入后材料的降解、吸收及組織相容性研究:動物模型建立:將所選兔隨機均分為兩組,其中實驗組兔在脊柱兩側約2cm處等距離各選2個植入點,每點間隔2cm,左右兩側各2個點植入膠原蛋白海綿。手術切開皮膚,分離皮下組織和筋膜,以止血鉗分離植入點肌肉,將膠原蛋白海綿植入深度為1.0-2.0cm的肌肉內,縫合肌肉及皮膚;空白對照組手術切開皮膚,分離皮下組織和筋膜,以止血鉗分離植入點肌肉,然后縫合肌肉及皮膚。實驗后連續3d每只注射20×104U/d的青霉素,以防感染。術后觀察創面愈合情況,術后2,4,8,12周每次取材3只。膠原蛋白海綿動物體內降解、吸收的組織病理觀察:所有兔單籠喂養,術后觀察記錄傷口愈合情況。分別于術后2,4,8,12周處死新西蘭兔,取出脊柱兩側肌肉,觀察海綿植入后不同時期的降解率。取包裹試樣周圍0.5-1.0cm的肌肉組織,體積分數10%甲醛固定,蘇木精-伊紅染色,光學顯微鏡下觀察炎癥反應(分級)、細胞種類數量特征、包囊形成情況。主要觀察指標:膠原蛋白海綿的生物特性及體內降解吸收。2結果的結果2.1動物的數量分析2.3膠原蛋白海綿的吸收峰分析膠原由3條α肽鏈組成,α肽鏈自身為α螺旋結構,3條α肽鏈則以平行、右手螺旋形式纏繞成“草繩狀”三股螺旋結構。采用圓二色譜法測定膠原溶液、膠原蛋白海綿二級結構特征,結果顯示兩者圖譜具有非常好的重疊性(圖1C),均在220nm有一強的正特征吸收峰,206nm左右有一強負特征吸收峰,具有典型膠原蛋白三螺旋結構的特征吸收性質,說明在膠原溶液凍干成海綿過程中膠原構象并未發生變化。對圓二色譜所測數據采用Cdpro軟件分析膠原蛋白海綿中不同二級結構所占的比例,其中α螺旋含量為34.4%,β折疊為33%,β轉角為16.8%,無規卷曲為16.4%。與對照組膠原溶液一致。圓二色譜同時可以反映膠原溶液與膠原蛋白海綿的變性溫度,當膠原蛋白的三螺旋結構被完全破壞時,正峰會完全消失。如圖2所示,以220nm處吸收峰的變化為例說明,縱坐標反映二級結構α螺旋構象的變化情況,顯示膠原溶液在33℃之后正吸收峰值開始降低,構象遭到破壞,隨著溫度進一步升高,當溫度達到50℃左右,蛋白變性達到最大程度;膠原蛋白海綿在30℃左右正吸收峰值開始降低,隨著溫度升高到達48℃構象完全遭到破壞,二者變性溫度基本一致。2.4各時間點海綿降解率及病理組織分析實驗組術后2周傷口痊愈,未出現出血、紅腫、壞死和試樣排出等異常現象,海綿的降解率為0。術后第2,4,8,12周取材,第4周可見到膠原蛋白海綿,海綿的降解率為0,第8周海綿的降解率為33%,至12周海綿降解率達75%(圖3)。病理組織切片分析顯示,第2周植入部位有明顯異物反應,可見較多單核細胞及少量異物巨細胞浸潤,組織炎癥反應小于Ⅲ級(圖4A);第4周植入部位可見較多增生結締組織,其中散在單核細胞浸潤,未見異物巨細胞,炎癥反應小于Ⅰ級,且未見明顯纖維囊結構(圖4B);術后第8周,植入部位可見較多纖維結締組織增生并發生玻璃樣變,散在單核細胞浸潤,未見異物巨細胞(圖4C);隨著植入時間達12周,植入部位未見單核細胞、淋巴細胞及異物巨細胞浸潤,炎癥反應逐漸消失,可見脂肪細胞,且有結締組織增生(圖4D)。空白對照組在實驗過程中均未出現異物反應(圖4E)。3差示量熱掃描分析及圓二色譜分析在形貌特征方面,作為組織工程使用的支架,膠原蛋白海綿其疏松多孔結構有利于細胞黏附,本實驗制備的海綿具有疏松多孔結構,孔徑平均為100μm,孔隙率約95.8%,多孔結構均一、致密。與文獻報道的優化海綿的孔徑基本一致,但孔隙率占優勢。膠原蛋白的生物活性依賴于其三級結構的完整性,本實驗通過電鏡觀察和圓二色譜分析其三級結構,驗證膠原蛋白海綿的生物活性。與大量文獻報道一致,電鏡下觀察到膠原具有的特殊的周期性橫紋區帶。圓二色譜是測定溶液中蛋白質二級結構的一種快速、簡單方法,還可以用于研究蛋白質受溫度影響時構象的變化情況。本實驗通過將膠原蛋白海綿溶解獲得的膠原蛋白溶液進行圓二色譜分析,發現在220nm附近出現正峰,202nm左右出現負峰。與大量文獻報道的具有三螺旋結構的活性膠原蛋白圓二色特征吸收峰相一致,說明膠原蛋白經凍干工藝形成海綿的過程中,其二三級結構仍保持完整,具有良好的生物活性。熱變性溫度是反映膠原蛋白天然螺旋結構完整性的一項重要指標,當體系溫度達到變性溫度Td時,膠原分子從伸展的纖維狀轉變為無規則卷曲狀。差示量熱掃描分析及圓二色譜分析是研究熱變性溫度的常見方法。有研究表明利用圓二色譜分析正峰強度的變化,在一定程度上能夠反映膠原蛋白結構的變化,當膠原蛋白的三螺旋結構被完全破壞時,220nm的正峰會完全消失。本實驗通過圓二色譜分析膠原溶液220nm的正峰變化,當溫度升至35℃以上,膠原的圓二色性發生強烈改變,正峰強度急劇減小,膠原蛋白三股螺旋立體結構被破壞,膠原蛋白發生變性,與文獻報道差示量熱掃描分析測定的牛源、魚源膠原蛋白變性溫度基本一致。膠原蛋白海綿屬于天然可降解生物活性材料。本實驗通過體內埋植實驗驗證膠原蛋白海綿生物相容性,植入初期在植入部位有少量炎性細胞聚集,局部組織出現異物反應,這屬于機體對異物的正常反應;隨著創面的愈合,植入部位的炎性細胞逐漸減少,周圍結締組織增生明顯,炎癥反應逐漸消失。組織病理學檢查發現,肌肉植入第4-8周降解比較顯著,到第12周材料可見率低于25%,在整個材料植入和降解周期內無明顯纖維囊結構形成,植入部位未見組織壞死情況發生,植入機體后除輕微和短時的炎癥反應外,未發生嚴重不良反應,材料與組織的生物相容性良好。這與Anselme等將膠原海綿皮下植入的組織反應、超微結構、免疫學研究、降解周期(3個月)相一致。基于膠原蛋白海綿良好的生物相容性和可降解性,大量研究及應用以膠原基生物材料,結合細胞種植或添加其他活性物質如慶大霉素、生長因子等,進一步拓展了其應用范圍,因此膠原蛋白海綿將在生物材料領域發揮其重要的潛在價值。文章亮點:1膠原蛋白海綿是由膠原溶液經凍干形成,是基于膠原生物材料的一種主要產品形式,已被廣泛應用于各種創面止血,組織殘腔的填充修復。2實驗首次系統地表征膠原蛋白海綿材料的生物特性,包括孔徑、孔隙率、電鏡結構、二級構象及熱穩定性,并通過動物體內埋植實驗驗證了膠原蛋白海綿的生物相容性及降解吸收特性。遲妍妍,樂堯金,劉旭昭,李琪,雷靜,湯順清.膠原蛋白海綿的生物特性及體內降解吸收[J].中國組織工程研究,2014,18(34):5515-5519.ChiYY,LeYJ,LiuXZ,LiQ,LeiJ,TangSQ.Biologicalproperties,degradationandabsorptionofcollagenspongesinvivo.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2014;18(34):5515-5519.24只新西蘭兔均進入結果分析。掃描電鏡分析經測定膠原蛋白海綿孔徑分布為40-150μm,平均100μm,孔壁1μm左右,孔隙率約95.8%,呈纖維細絲網狀結構,見圖1A。圖1B顯示的是膠原蛋白海綿的透射電鏡圖,膠原纖維呈現分散態,纖維直徑200-300nm,可觀察到膠原具有的特殊的周期性橫紋區帶。2.2實驗材料及倫理要求作者貢獻:湯順清對實驗的總體構思和布局提供指導,動物實驗部分及文章部分撰寫由遲妍妍負責,樂堯金完成膠原蛋白海綿生物表征部分(電鏡結構、二級構象、熱穩定性)并完成文章內容的部分撰寫,劉旭昭參