可提取性核抗原（ENA）自身抗體檢測——免疫印跡法（WesternBlot）WesternBlot是將蛋白質經分離后從凝膠轉移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進行檢測。本法綜合了SDS的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，可分辨10-100ng的蛋白質，不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

抗原等蛋白樣品經SDS處理后帶負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。

電轉移

將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上。

酶免疫測定

將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。

廣泛用于蛋白質樣品分析研究

電泳

帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優點，使它成為分離、鑒定和提純核酸與蛋白質的首選標準方法。影響泳動率的四大因素1．樣品的物理性狀影響泳動率的首要因素是電泳樣品的物理性質，包括分子大小、電荷多少、顆粒形狀和空間構型。一般來說顆粒帶電荷的密度愈大，泳動速率愈快；顆粒物理形狀愈大，與支持物介質摩擦力越大，泳動速率越小。即泳動率與顆粒的分子大小，介質粘度成反比；與顆粒所帶電荷成正比。2．支持物介質凝膠電泳常使用兩種支持材料，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。通過這兩種介質的濃度變化調整所形成凝膠的分子篩網孔大小，分離不同分子量的核酸片段或多肽片段。瓊脂糖凝膠的孔徑大，聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小。在電場中，液體對于固體支持物的相對運動稱為電滲。凝膠電泳的電滲作用很小。3．電場強度電場強度愈大，帶電顆粒的泳動速度愈快，但凝膠的有效分離范圍隨電壓的增大而減小。4．緩沖液離子強度緩沖液是電泳場中的導體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。電泳的指示劑和染色劑1．指示劑電泳過程中，常使用一種有顏色的標記物以指示樣品的遷移過程。常用的指示劑有兩種：溴酚藍呈藍紫色；二甲苯青呈蘭色。溴酚藍的分子量為670dal，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本相同，它的分子篩效應小，近似于自由電泳，故被普遍用作指示劑。2．染色劑電泳后，樣品需經過染色才能顯示出帶型。凝膠中的蛋白可用考馬斯亮藍染色或銀染顯跡。核酸最常用的是溴乙錠染色。麗春紅染膜。聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據電泳樣品的電荷，分子大小及形狀的差別分離物質，這種介質既具有分子篩效應，又具備靜電效應，所以分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳，它適用于低分子量蛋白質（低于100道爾頓），寡核苷酸的分離和DNA的序列分析。聚丙烯酰胺的凝膠電泳具備分離只相差1個核苷酸的不同DNA片段的特性，是DNA序列分析因素中的關鍵技術之一。丙烯酰胺（Acr）單體，在催化劑N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）和過硫酸胺（AP）的存在下，丙烯酰胺產生聚合反應，形成長鏈，加入交連劑N，N’-亞甲雙丙烯酰胺（Bis），聚丙烯酰胺鏈就會交叉連接而形成凝膠。凝膠的網孔大小取決于聚合鏈的長度及交連的程度。1個交叉連接的聚丙烯酰胺分子，最少包含29個丙烯酰胺單體。聚合鏈的長度決定于聚合反應中的單體丙烯酰胺濃度。凝膠中網格的孔徑由Acr與Bis的相對比例決定，調節單體與交連劑的濃度比例，可形成不同孔徑的網格,其中亞甲雙丙烯酰胺的濃度愈低，孔徑愈大。適用于分離大分子物質。聚丙烯酰胺凝膠常規灌制于兩塊封閉的平板之間，然后進入垂直電泳。其理由主要是氧能抑制丙烯酰胺的聚合反應，在閉封的雙玻璃平板的夾層中灌膠后，僅有頂層的部分凝膠與空氣中的氧氣接觸，從而大大降低了氧對聚合的抑制作用。SDS電泳：SDS十二烷基硫酸鈉，是一種洗滌劑的成分。帶有大量的負電荷，SDS能夠打斷氫鍵和疏水鍵，等距離插入肽鏈，消除其原有的電荷，使之帶負電。還原劑巰基乙醇則能夠破壞蛋白質二硫鍵，使蛋白的構相和形狀發生改變，幾乎全部成長橢圓狀。因此，各蛋白在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，僅與分子量有關。不連續電泳

指使用不同孔徑和不同緩沖系統的電泳。由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進行分離。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續電泳的分辨率大大高于連續電泳。雖然不連續電泳在緩沖系統的選擇和制膠（特別是梯度膠）的操作方面比較繁雜，但它可以得到電泳分離最重要的指標——高分辨，因而是目前應用最廣泛的技術。濃縮膠的作用原理在緩沖系統中的甘氨酸，在接近其pKa（弱酸的電離平衡常數）的pH值時，只有一部分分子帶負電。

樣品和濃縮膠均用pH6.8的Tris-HCI緩沖液，電泳液用Tris-甘氨酸緩沖液。此時，甘氨酸很少解離，有效泳動率很低，氯離子卻有很高的泳動率，蛋白質分子的泳動率介于其間。

一旦加上電壓，作為先導離子的氯離子和作為尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個導電性較低的區帶。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便獲得較高的電壓梯度，并加速甘氨酸的泳動，使其趕上氯離子,使這些帶電顆粒以相同速度泳動。由于在移動界面前的蛋白質泳動速度比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動界面后的蛋白質處于較高的電壓梯度中，其泳動速度比甘氨酸快。因此，移動的界面將蛋白質分子堆積到一起，濃縮為一狹窄的區帶。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對樣品沒有分子篩作用。當移動的界面到達濃縮膠和分離膠的界面時，凝膠的pH值明顯增加，并導致甘氨酸的大量解離。此時甘氨酸的有效泳動率增加，使它越過蛋白質并直接在氯離子后移動。同時由于凝膠孔徑變小，使蛋白質分子的遷移率減小。于是蛋白質分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動，并根據其分子大小進行分離。蛋白質大小與凝膠濃度5％57~212kd7.5%36~94kd10%16~68kd12.5%15~60kd15%15~45kd20%2~15kd一、SDS電泳（一）試劑和材料1、30％凝膠貯備液：含29％（W/V）丙烯酰胺2、1％（W/V）N，N－亞甲雙丙烯酰胺：用去離子水配制，避光貯存于棕色瓶中。3、10％SDS，去離子水配制，貯存于室溫中4、TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙烯二胺）5、10％過硫酸胺：用無離子水配制少量，最多4℃貯存一周；6、濃縮膠電泳緩沖液Tris-HCl（PH6.8）。分離膠電泳緩沖液Tris-HCl（PH8.8）7、電泳緩沖液：Tris-甘氨酸（PH8.3）

8、樣品緩沖液9、ENA：用PH7.40.01MPBS從牛胸腺丙酮粉中抽提，濃度為5mg/ml，－70℃保存備用。10、垂直電泳槽、電泳儀、穩壓器、微量加樣器、滴頭、EP管、吸管等。（二）實驗方法：1、準備玻璃板2、配制分離膠：總量5ml水1.6ml30％丙烯酰胺溶液2.0ml1.5mol/LTris(PH8.8)1.3ml10％SDS0.05ml10％過硫酸銨0.05mlTEMED0.002ml3、配制濃縮膠：總量2ml水1.385ml30％丙烯酰胺溶液0.325ml1.0mol/LTris(PH6.8）0.25ml10％SDS0.02ml10％過硫酸銨0.02mlTEMED0.004ml將配制好的濃縮膠注入分離膠上端，插入梳子，應小心避免氣泡。上樣緩沖液：

100mmol/LTris-Cl（PH6.8）

200mmol/L二巰基乙醇（還原劑）

10%SDS

0.2%溴酚蘭

20%甘油（穩定蛋白的作用）4、加樣：將ENA與上樣緩沖液等體積混合，煮沸3~5min后，將其加入梳孔內，每孔20l。5、電泳：開始時電壓為8V/cm凝膠，染料進入分離膠后，將電壓增加到15V/cm凝膠，繼續電泳直到染料抵達分離膠底部，斷開電源。6、染色：取下凝膠，切下一部分染色，其余用于電轉移。二、電轉移：蛋白蛋從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉移至NC膜

（一）材料轉移緩沖液、轉移電泳槽、電泳儀、穩壓器、NC膜、Whatman3MM濾紙、海綿等（二）方法1、剪6塊濾紙和一塊NC膜，其大小應與SDS凝膠的大小相同。如果紙或膜比凝膠大，在轉移過程中會形成短路。2、將剪好的3MM濾紙及NC膜在轉移緩沖液中浸泡3~5分鐘。3、按下列過程安裝轉移裝置：（1）將塑料支架平放在含有轉移緩沖液的托盤中，在塑料支架上放一塊海綿。（2）將3塊3MM濾紙對齊放在海綿上，依次放置NC膜、凝膠、另外3塊3MM濾紙及海綿。在放置每一層時，均要去除它們之間的氣泡，若有氣泡殘留，則影響轉移效果。（3）最后用塑料支架夾緊上述各層，放入電轉移槽內，注意NC膜一側靠正極，膠一側靠負極。4、接通電源，電壓40V，電流0.17-0.2A，轉移1.5-6小時，轉移時間可根據靶蛋白的大小來定，蛋白質分子量小則需時短，蛋白質分子量大需時長。5、轉移結束后，取出塑料支架，依次去掉各層，用鉛筆在膜的上緣作好標記。6、標記好的NC膜放在一張干凈的濾紙上，室溫下干燥30~60min。7、切下部分NC膜，麗春紅染色觀察轉印情況。8、在標記好的上緣用蘸有人IgG的鋼筆劃一條線。三、固相酶免疫測定檢測ENA（extractablenuclearantigen）自身抗體1、材料（1）洗滌液：含0.05％吐溫-20的PH7.4的PBS（2）酶標抗人IgG（3）陰性對照血清、陽性對照血清（4）底物溶液（5）終止液（6）已轉印有ENA的NC膜。（7）恒溫搖床、微量加樣器、反應槽、塑料袋、滴管、吸管等。2、方法（1）切下數條已轉移有ENA的NC膜。（2）封閉（用1％的牛血清白蛋白4℃過夜）。（3）洗滌液漂洗5次，每次1min。（4）加樣：1ml洗滌液加入20μl血清，37℃恒溫搖動40分鐘。（5）洗滌液漂洗5次，每次1min。（6）加入1ml酶標羊抗人IgG，37℃恒溫搖動40mins。（7）洗滌液漂洗5次，每次1分。（8）加入底物液1ml，顯色10min。（9