楊樹基因標記的研究進展

楊樹科和楊樹科共有100多種植物分布在歐洲、美國和亞洲。它們是保護森林、水土保護林、綠樹和人類工林公石的重要樹種。近年來，森林科學家對生理生化、解剖構造等基本資料進行了深入研究，對促進柳樹遺傳改良產生了重大影響。然而，傳統育種中的抗病、抗蟲性、性別決定和早期造林選擇等問題并不能從根本上解決。因此，應盡快研究楊樹的生物學。楊樹種間雜交和無性繁殖容易,楊屬所有種的染色體數均為2n=38,核基因組相對較小(2c=1.1~1.2pg),便于遺傳操作,并已建立較完善的遺傳轉化體系,獲得了轉基因植株.因此,楊樹是公認的林木生物學基礎研究中的模式樹種.由于楊樹種間雜交容易,在F1代有很強的雜種優勢(材積生長量),雜種的F2代在許多性狀方面可發生廣泛的分離,所以大量的分離群體在F1代或F2代很易建成.十幾年來,前人利用分子標記技術對楊樹基因組進行了指紋圖譜繪制、遺傳圖譜構建及數量性狀基因定位.在楊樹中,常用的分子標記為RFLP,RAPD和AFLP,它們是繼形態標記(Morphologicalmarkers)、細胞學標記(Cytologicalmarkers)和生化標記(Biochemicalmarkers)之后發展起來的一種以DNA多態性為基礎的新一代遺傳標記.與形態標記和生化標記相比,分子標記具有明顯的優越性:大多數分子標記是共顯性的,基因組變異極其豐富,分子標記的數量幾乎是無限的,在植物發育的不同階段,不同組織的DNA都可用于標記分析;分子標記不受環境影響,其變異只源于等位基因DNA序列的差異,與不良性狀無必然的連鎖,不需專門創造特殊的遺傳材料[7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20].基于上述這些優點,分子標記技術可為楊樹生產提供準確、可靠的遺傳標記.1林分密度標記rflp和雙熒光標記rapds分子標記是分子生物學發展的產物.80年代初,發展了RFLP,隨后其發展極為迅速,產生了多種分子標記技術,用于楊樹遺傳育種的主要有以下3種.(1)RFLPRFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms)指限制性片段長度多態性,是楊樹遺傳育種中使用較多的一種分子標記.RFLP在林木遺傳育種中的應用是從1986年開始的,迄今也開展了大量的研究.RFLP技術的原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小.其基本步驟包括基因組DNA的限制性酶切,電泳分離,利用探針進行Southern雜交來檢測基因組DNA.RFLP標記具有共顯性的特點,結果穩定可靠,重復性好,特別適應于建立連鎖圖.然而,RFLP必須經過DNA酶切、電泳、Southern雜交,費時、費力、周期長,每次實驗檢測的位點較少,對DNA需求量較大(5~10μg),需用放射性同位素或非放射性物質標記探針,探針的種屬特異性較強,楊樹已有的探針不超過300個,這是RFLP應用在楊樹中的主要問題.另外,RFLP對DNA多態性檢出的靈敏度不高,RFLP連鎖圖上還有很多大的空間區(Gaps).(2)RAPDsRAPDs(RandomAmplifiedPolymorphicDNAs)為隨機擴增多態性DNA,是一項基于PCR技術基礎之上,用一個隨機引物(8~10個堿基)非定點地擴增DNA片段,然后用凝膠電泳分離擴增片段來進行DNA多態性研究[7,8,9,10,11,12,13].與RFLP相比,它較便宜,方便易行,非常靈敏,DNA用量少,實驗設備簡單,不需DNA探針;設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析,不依賴于種屬特異性和基因組的結構,合成一套引物可以用于不同生物基因組分析,用一個引物就可擴增出許多片段,而且不需要同位素,安全性好.因此,繼RFLP之后,RAPD是在楊樹研究中應用最廣泛,特別是在尋找與目的基因連鎖的分子標記方面,報道最多.但是,RAPD受條件影響很大,因此對設備、條件及超作的要求都很嚴格,若達不到要求,穩定性和重復性就很難保證,解決的辦法是嚴格控制實驗條件,使用相同的PCR儀和引物.(3)AFLPAFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms)擴增片段長度多態性,是1992年由荷蘭Keygene公司科學家Zabeau和Vos發明創造的一種DNA分子標記新技術.其基本原理是植物基因組DNA經限制性內切酶雙酶切后,形成分子量大小不等的隨機限制性片段,將特定的接頭(adapter)連接在這些DNA片段的兩端,形成一個帶接頭的特異片段,通過接頭序列和PCR引物3’末端的識別,特異性片段經變性、退火和延伸周期性循環而擴增,最終通過聚丙烯酰胺電泳分子篩作用,將這些特異的限制性片段分離開來.AFLP是在RFLP和RAPD的基礎上發展起來的.它是RFLP和RAPD的結合,它集中了二者的長處,既有RFLP的可靠性,又有RAPD的方便性.也就是說它不僅具備了其它DNA分子標記技術所具有的特點,多態性豐富,共顯性表達,不受環境影響,無復等位效應,而且還具有帶紋豐富,用樣量少,靈敏度高,快速高效等特殊優點.通過一些實驗室和科學家的使用和驗證,AFLP被認為是一種十分理想的、有效的分子標記技術,它可以在短時間內提供巨大的信息量.盡管它產生時間還不長,即在林木指紋圖譜技術、遺傳圖譜構建中使用很廣泛,預計AFLP在楊樹分子育種中將發揮更大的作用.其缺點為:實驗成本較高,基因組的不完全酶切影響實驗結果,所以實驗對DNA純度和內切酶的質量要求較高,同時要求實驗人員有很高的操作技能.2分子標記在遺傳育種中的應用作為一種有效的遺傳標記,分子標記直接以DNA為研究對象,在楊樹遺傳育種方面應用廣泛,分子標記在無性系指紋圖譜構建、遺傳圖譜構建和數量性狀基因定位中研究進展較快,這些開創性工作為楊樹育種,利用分子標記進行輔助選擇奠定了必要的理論基礎.2.1rapd指紋圖譜的建立指紋圖譜(Fingerprinting)是鑒別品種、品系和無性系(包括雜交親本和自交系)的有力工具.90年代以前,指紋圖譜構建主要是同工酶方法,而目前主要是DNA水平的分子標記技術.由于楊樹分布廣,在長期的自然演化和種間雜交過程中形成了生態適應性各異、數量龐大的一些變異的新種和新的無性系,為了正確地保護和利用遺傳資源,應利用分子標記技術對楊樹無性系鑒定進行研究,以便于在世界范圍內廣泛交流,為充分利用這些無性系提供一個可靠的依據.分子標記最為直接的應用是對單株進行指紋分析,最早是利用RAPD技術進行無性系指紋圖譜構建.S.Castiglione等人(1993)利用RAPD標記,對楊屬不同種的32個無性系,進行了分析,共用18個引物并從中篩選出4個引物用于PCR擴增反應來區分這些無性系,它們共擴增出120個不同的DNA帶,其中多態帶占92%,通過統計分析來確定遺傳關系,證明即使在形態和物候基礎上不能識別的無性系,利用RAPD技術仍可鑒別出來,該研究指出,生長在不同地點的同一無性系植株其指紋沒有差異.Silvia,Cortizo等人(1996)用RAPD標記技術對廣泛種植在阿根廷的12種美洲黑楊進行無性系鑒定,結果表明:那些從形態上難以分辨的無性系,用RAPD標記可以對這些無性系進行區分;隨后,N.Sanchez等人利用RAPD標記對黑楊(P.nigra.)、美洲黑楊(P.deltoides)、銀白楊(P.alba)、歐洲山楊(P.tremula)、毛果楊(P.trichocarpa)25個無性系進行了鑒定,他們發現每個種及每個種內的無性系所表現出的RAPD帶都不一樣,從而根據這些譜帶來區分楊屬不同種;尹佟明等人(1998)首次把AFLP標記用于楊屬指紋圖譜構建中,他們使用兩個引物組合(E-ACA和M-CAG;E-AAC和M-ACT)構建了美洲黑楊42個無性系的AFLP指紋圖譜,每個無性系的擴增譜帶數都在50條以上,擴增片段大小在0.3~1.5kb之間.由于這些材料親緣關系較近,大多數多態譜帶不僅對某一無性系特異,但就對每一無性系而言,這些多態譜帶構成了每一無性系的特征譜帶組合,根據每一無性系的特征譜帶組合,可以鑒別不同的無性系.2.2分子標記連鎖圖譜遺傳圖譜的構建是基因組研究中的最基礎的工作,可為基因定位與克隆及基因組結構和功能的研究奠定基礎.構建遺傳圖譜,需要適當的分離群體和家系,還需要大量能揭示親本多態性的遺傳標記.隨著以RFLP為代表的分子標記的出現,遺傳作圖在許多林木中得到了飛速發展.國際上已有20多個國家開展了30多個樹種的遺傳圖譜構建和數量性狀基因位點的定位研究.楊樹的遺傳圖譜構建起步雖較晚,進展相當迅速,但由于楊樹是林木遺傳研究的模式樹種,其遺傳圖譜的構建具有重要的理論意義和應用前景.第一個用分子標記進行楊樹遺傳圖譜構建的是Minnesota大學的Liu和Furnier,他們(1993)以美洲山楊(P.tremuloidesMichx)5個全同胞家系為材料利用RFLP標記和等位酶標記構建了世界上第一張楊樹遺傳圖譜,該圖譜包含了54個RFLP標記和3個等位酶標記,形成14個連鎖群,覆蓋基因組總長約664cM;隨后,華盛頓大學的H.D.BradshawJr和M.Villar等(1994)用毛果楊(P.trichocarpa)為母本,美洲黑楊為父本,產生的F2群體為材料,采用了3種不同的分子標記RFLP,STS,RAPD構建了包括343個分子標記的遺傳連鎖圖譜,其中有111個RAPD標記,215個RFLP標記,17個STS標記,估計楊樹基因組長度為2400~2800cM,通過連鎖分析有312個標記分屬于35個不同的連鎖群,其中最大的19個連鎖群覆蓋基因組總長約1261cM,覆蓋率為48.5%.我國楊樹遺傳連鎖圖譜研究進展較快,南京林業大學與中國科學院遺傳研究所合作(1999)利用RAPD標記,以響葉楊(PopulusadenopodaMaxim.)×銀白楊(P.albaL.)的F1群體為材料,分別構建了響葉楊和銀白楊的分子標記連鎖圖譜.實驗過程中對600個隨機的寡核苷酸引物進行了重復篩選,共選出128個引物用于作圖群體的隨機擴增,作圖群體大小為82個單株(包括雙親),結果獲得了326個擬測交位點和7個3∶1分離位點,擬測交位點中有238個位點來源于銀白楊,有88個位點來源于響葉楊.經偏分離檢測,用于銀白楊作圖的位點共計212個(26個位點偏分離),用于響葉楊作圖的位點共計78個(10個位點偏分離).利用多點連鎖分析,銀白楊中有189個連鎖標記構成了20個不同的連鎖群,6個三連體和16個連鎖對,連鎖標記覆蓋的總圖距為2402.4cM.而響葉楊有41個連鎖標記分屬于12個不同的連鎖群,標記覆蓋的總圖距為479.4cM,獲得了中等密度的銀白楊連鎖圖譜和響葉楊圖譜的一個連鎖框架.目前國內外在林木遺傳圖譜研究中,一般采用擬測交策略,即分別構建父本和母本的兩張不同的連鎖圖,它不能把基于不同親本的連鎖圖整合到一張圖上,主要是因為缺少足夠的信息,從而使在親本1中分離而在親本2中固定的分子標記不能與在親本2中分離而在親本1中固定的分子標記關聯起來,而通過那些在雙親中均分離的標記,可以使兩張圖連結成一體.隨后,南京林業大學、中國科學院遺傳研究所、美國北卡羅來納州立大學合作,利用RAPD標記和美洲黑楊×歐美楊(P.euramericana)的F1群體,構建了美洲黑楊×歐美楊的分子標記連鎖圖譜,作圖群體大小為92個,實驗過程中對1040個10堿基寡核苷酸隨機引物進行了重復篩選,共選出127個引物用于作圖群體的隨機擴增,這127個引物產生229個多態位點,利用多點連鎖分析,形成19個連鎖群及6個三連體和14個連鎖對.由19個連鎖群構成的圖譜含標記129個,總圖距為1914.2cM,覆蓋楊樹基因組約73.62%,標記間的平均間距為14.84cM,該研究獲得了中等密度的美洲黑楊×歐美楊的一個連鎖框架.在該研究中,此類型的基因位點較多說明了“三交”(Tripcross)群體在分離位點的顯示效率以檢測復等位基因分離方面具有高效性.中國林業科學研究院與英國牛津大學合作,利用RAPD方法,在美洲黑楊×青楊(P.cathayanaRehd.)3代譜系中分析分子標記,構建出美洲黑楊×青楊分子標記連鎖圖譜,該圖譜由20個連鎖群,110個RAPD標記組成.總圖距為覆蓋基因組總長度的70.35%,標記間的平均間距為17.27cM.該圖譜為楊樹抗病蟲和其它性狀基因定位提供了框架結構,為實現楊樹分子遺傳育種邁進了最重要的一步.隨著多種遺傳標記方法的逐步完善和發展,人們正在努力探索應用多種分子標記進行基因組研究.隨著林木遺傳圖譜構建的深入研究,構建出高密度的遺傳圖譜及對目的基因進行定位,其使用價值將日益提高,使用范圍也將不斷擴大,將對林木遺傳育種產生深遠的影響.2.3苗木生長和苗木生長中的qp分子標記的應用利用分子標記技術對林木遺傳育種進行研究,一個重要方面是數量性狀基因定位(簡稱QTLs定位).QTLs定位,是闡明控制有關數量性狀的主要基因數目,這些基因在染色體上的位置,以及其自效應和聯合效應的遺傳圖.利用這種遺傳圖和分子標記技術,可使林木育種從表型選擇逐步過渡到基因型選擇,進一步利用QTLs定位的成果進行標記輔助選擇,大大提高育種效率.林木的QTLs定位研究是在農作物已開展QTLs探測之后開始的,并取得了較大的進展.目前,在QTLs作圖中較常用的方法為方差分析法(Analysisofvariance,ANOVA)、區間作圖法(Intervalmapping,IM)和復合區間作圖法.楊樹的QTLs定位工作主要集中于重要的經濟性狀,如生長、材性和抗性等.如美國華盛頓大學Bradshaw等人(1995)通過對毛果楊×美洲黑楊的F1群體遺傳圖譜的構建,利用連鎖圖上的分子標記對樹高、胸徑、材積、干形和分枝角等重要經濟性狀進行了QTLs定位研究,發現這些數量性狀變異的25%~96%是受1~5個QTLs控制的.例如苗木2年生時材積生長性狀的大部分變異是受4個QTLs控制(它們所控制的變異分量分別占遺傳變異的85%,占表型變異的49%),其中的3個QTLs為顯性方式遺傳,第4個QTLs呈超顯性遺傳.研究也表明,控制高生長的等位位點在毛果楊上是純合的,控制粗生長的等位位點在美洲黑楊上是純合的.研究還發現,QTLs可能在苗期和以后的生長期中有所變化,因此可根據QTLs作用隨時間的變化來預測林木的生長過程.中國林業科學研究院的李金花等人(1999)以美洲黑楊(母本)和青楊(父本)雜交獲得的F2群體80株為材料,應用RAPD標記檢測與F2群體3個數量性狀(苗高、地徑和封頂期)有關的QTLs,研究表明:①該研究檢測出分別與苗高、地徑和封頂期關聯的7,6和3個標記座位,其聯合貢獻率分別高達45.94%,41.17%,19.13%,但各標記座位對性狀的貢獻率較小,表明其均為微效基因.②用單因子方差分析檢測到與封頂期性狀關聯的RPL05-3與苗高性狀不關聯,但雙因素方差分析檢測發現,其分別與RPN04-2和RPH01-1的互作與苗高性狀相關聯,且互作對苗高的作用微小.大量研究證明林木葉片對林木生長量的重要性.經典數量遺傳學研究表明F2代葉片數量性狀間存在顯著相關性,但無法鑒別數量性狀基因在染色體上的位置及其遺傳效應,也難以確定相關性狀的QTLs間的關系.分子標記技術的出現,使得對林木葉片數量性狀研究進入到分子水平階段.美國的R.Wu和華盛頓大學的H.D.Bradshaw等人通過分子標記和數量遺傳方法以毛果楊×美洲黑楊種間雜交譜系為基礎,研究發現葉子色素、葉柄長和葉長比率受少數QTLs控制,并指出父母本毛果楊和美洲黑楊對于它們的雜交子代表型有不同的貢獻,例如控制葉緣綠色和葉柄的扁平程度的基因位點主要由美洲黑楊控制,而控制葉脈著生方向和葉片角度基因位點主要由毛果楊控制.又如中國林業科學研究院的蘇曉華等人(2000)利用數量遺傳學和RAPD標記相結合,對美洲黑楊與青楊雜交產生的F2群體5個葉片數量性狀進行了相關聯標記及其圖譜定位研究.用單因素方差分析檢測出與葉長、葉寬、葉長/葉寬、葉柄長和葉面積相關聯的RAPD標記分別為10,10,4,9,12個;聯合貢獻率分別為66.23%,61.82%,32.86%,59.67%,81.79%.用雙因素方差分析檢測出與互作QTLs緊密相關聯的標記位點共19對,其中與葉長、葉寬、葉長/葉寬、葉柄長和葉面積顯著相關聯標記分別有4對、2對、1對、5對、7對.與這5個性狀相關聯的標記多數集中分布于第4,12,15和17條連鎖群上.這些研究的目的是為實現楊樹分子標記輔助選擇育種提供依據和參考,有助于林木生長量的改良.2.4基于近等基因系的rapd分析標記輔助選擇(Marker-assistedselection,MAS)或稱標記輔助育種,是指通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記判斷目標基因是否存在.根據連鎖圖將目標基因定位在某一染色體上,就可選擇分散在染色體上不同位點的標記并逐漸逼近,這樣便很快找到該基因的分子標記.林木遺傳圖譜為在DNA水平上進行林木生長、材性和抗性等重要性狀的早期測定提供了依據,同時也提高了早期測定的精確度和可靠性,從而大大縮短了林木育種周期.在實際育種工作中,首先要確定目標性狀是由質量性狀或QTLs控制,利用與目標質量性狀基因緊密連鎖的分子標記,是進行質量性狀選擇的有效途徑.林木中,標記目標性狀基因的方法目前主要有兩種:一是利用近等基因系或Michelmore(1991)等提出的分離群體分組分析法(BulkedSegregantAnalysis,BSA),BSA是將F2分離群體中研究的目標性狀根據其表型(如抗病、感病)分成兩組,將每組內的一定數量的植株的DNA混合,形成按表型區分的DNA池,也稱近等基因系(IsogenicDNAPools),并用作模板進行RAPD分析.二是利用已有的連鎖圖進行標記.在楊樹基因定位中主要是采用BSA法,例如M.T.Cervera等以美洲黑楊×黑楊的F1代的葉片為材料,利用A