第六章補體參與的反應第六章補體參與的反應1

19世紀末，在發現體液免疫后不久，Bordet即證明，新鮮血清中存在不耐熱的成分，可輔助特異性抗體介導的溶菌作用。因其是抗體發揮溶細胞作用的必要補充條件，故被稱為補體。Bordet19世紀末，在發現體液免疫后不久，Bordet即證2SRBC+抗SRBC抗體不溶血SRBC+抗SRBC抗體＋新鮮動物血清溶血SRBC+抗SRBC抗體＋加熱處理新鮮動物血清不溶血37℃30min37℃30min37℃30minSRBC+抗SRBC抗體不溶血373補體(Complement,C)：是正常存在于人或哺乳動物血清與組織液中的一組被激活后具有酶活性的蛋白質。性質不穩定，加熱56℃30min，可使其滅活。補體的激活途徑：經典途徑、替代途徑、MBL途徑補體(Complement,C)：是正常存在于人或哺乳動物血4C1分子結構C1分子結構5免疫學檢驗-6-補體參與的反應課件6免疫學檢驗-6-補體參與的反應課件7圖1抗原（antigenAg）與抗體（antibodyAb）結合形成免疫復合物（immunecomplexIC）圖2免疫復合物與補體結合，使補體發生作用。AgAgAgAg圖1圖2Ab補體（complement）圖1抗原（antigenAg）與抗體（antibod8SRBC圖1綿羊紅細胞與溶血素（hemolysin）即抗綿羊紅細胞結合，形成致敏綿羊紅細胞（SRBCs）。圖2致敏綿羊紅細胞與補體結合，使其激活，補體發生溶細胞作用，引起紅細胞腫脹，發生溶血。圖1圖2SRBCSRBC補體(complement)SRBCSRBChemolysinSRBCsSRBCsSRBC圖1綿羊紅細胞與溶血素（hemolysin）即9

第一節補體結合試驗補體結合試驗(complementfixationtest，CFT):--是用免疫溶血機制做指示系統，來檢測

另一反應系統抗原或抗體的試驗。

早在1906年Wasermann就將其應用于梅毒的診斷，即著名的華氏反應。除了用于傳染病診斷和流行病學調查以外，在一些自身抗體、腫瘤相關以原以及HLA的檢測和分析中也有應用。第一節補體結合試驗10一、免疫溶血反應概念:是紅細胞-抗體復合物激活補體,導致紅細胞溶解的反應。參與成分:綿羊紅細胞-SRBC抗SRBC抗體-溶血素補體用途：測定血清總補體活性及單個補體成分功能活性。溶血素效價滴定。作為指示系統，參與補體結合試驗。一、免疫溶血反應概念:11溶血素效價的測定試驗原理：經綿羊紅細胞（SRBC）免疫的動物（小鼠或家兔）血清中可出現抗SRBC的抗體。采集免疫動物血液分離血清，即可獲得抗SRBC的抗血清。當用SRBC與相應抗血清混合，有補體存在時，在一定條件下，SRBC被溶解破壞。因此抗SRBC抗體又稱為溶血素。溶血素效價的測定試驗原理：經綿羊紅細胞（SRBC）免疫的動物12溶血素效價使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀釋度。溶血素效價13免疫溶血反應的試劑稀釋緩沖液常用pH7.2-7.4的PBS或BB：有利于AgAb結合和補體活化。加入適量NacCl:保持等滲和提供Ca2+Mg2+。補體：檢測補體：采用新鮮血清。補體結合試驗：采用新鮮豚鼠血清。綿羊紅細胞：采用2%~5%的SRBC懸液。用緩沖液配制。免疫溶血反應的試劑稀釋緩沖液14溶血素SRBC免疫家兔而得到的抗血清。試驗前需滅活補體。溶血素稀釋：按右表稀釋。溶血素效價滴定:確定溶血素的效價(1個溶血素單位）。試驗時一般使用2個溶血素單位。溶血素15按表將試劑加入試管后，37℃水浴30min，觀察結果。以完全溶血的溶血素最高稀釋度為效價，本例中的溶血素效價為1∶4000，即為1個溶血素單位。試驗時，用2個溶血素單位（在本例做1∶2000稀釋）。

按表將試劑加入試管后，37℃水浴30min，觀察結果。16一、CFT試驗原理

有5種成分參與反應，分屬于3個系統：①反應系統:即已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）；②補體系統:③指示系統:即SRBC與相應溶血素，試驗時常將其預先結合在一起，形成致敏紅細胞。反應系統與指示系統爭奪補體系統，先加入反應系統給其以優先結合補體的機會。一、CFT試驗原理17免疫學檢驗-6-補體參與的反應課件18AgAb補體抗體陽性待檢系統指示系統

溶血反應紅細胞溶血素不溶血抗體陰性AgAb補體紅細胞溶血素溶血補體結合試驗陽性陰性AgAb補體抗體陽性待檢系統指示系統溶血反應紅細胞溶血素不19二、試驗方法較常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。以后兩種方法應用較為廣泛，因為可以節省抗原，血清標本用量較少，特異性也較好。以下敘述以小量法為例:即抗原,抗體,溶血素,羊紅細胞各加0.1ml,補體加0.2ml，總量為0.6ml。二、試驗方法20（一）試劑1．抗原：試驗中用于檢測抗體的抗原應適當提純，純度愈高，特異性愈強。如使用粗制抗原時，須經同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應。（一）試劑212．抗原和抗體的滴定：多采用方陣法進行滴定,選擇適宜的抗原與抗體濃度比例。選擇抗原與抗體兩者都呈強陽性反應（100％不溶血）的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價（單位）。正式試驗中，抗原用2～4個單位，抗體用4個單位。2．抗原和抗體的滴定：22抗原和抗體的方陣滴定

注：0表示100%溶血，1表示75%溶血，2表示50%溶血，3表示25%溶血，4表示100%不溶血。抗原和抗體的方陣滴定注：0表示100%溶血，1表示75%溶233、補體的滴定：一般用豚鼠補體，補體滴定按下表逐步加入各試劑，溫育后觀察最少量補體能產生完全溶血者，確定為1個實用單位，正式試驗中使用2個實用單位。3、補體的滴定：24（二）血清標本采集血液標本后及時分離血清，及時檢驗或將血清保存于－20℃。血清在試驗前應先加熱56℃30min(或60℃3min)以破壞補體和除去一些非特異因素。（二）血清標本25血清標本遇有抗補體現象時可做下列處理之一：

①加熱提高1~2℃；

②－20℃凍融后離心去沉淀；

③以3mmol/L鹽酸處理；

④加入少量補體后再加熱滅活；

⑤以白陶土處理；

⑥通入CO2；

⑦以小白鼠肝粉處理；

⑧用含10％新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋補體。免疫學檢驗-6-補體參與的反應課件26（三）正式試驗--小量法按表逐步加入各種試劑，溫育后先觀察各類對照管，應與預期的結果吻合。（三）正式試驗--小量法27三、方法評價

①靈敏度高。補體活化過程有放大作用，比沉淀反應和凝集反應的靈敏度高得多，能測定0.05μg/ml的抗體,可與間接凝集法的靈敏度相當。

②特異性強。各種反應成分事先都經過滴定，選擇了最佳比例，出現交叉反應的機率較小，尤其用小量法或微量法時。

③試驗結果顯而易見；

④易于普及，試驗條件要求低，不需要特殊儀器或只用光電比色計即可。三、方法評價28補體結合試驗可應用在以下幾方面：①傳染病診斷病原性抗原及相應抗體的檢測②其他抗原的檢測例如腫瘤相關抗原、血跡中的蛋白質鑒定、HLA分型等③自身抗體檢測補體結合試驗可應用在以下幾方面：29補體結合試驗的缺點：

①影響因素復雜，操作繁瑣且要求嚴格，稍有疏忽便影響結果；

②補體性質不穩定，難于標準化；

③若抗原或待檢血清有抗補體作用，則試驗難以進行。補體結合試驗的缺點：30第二節補體測定

一、補體經典途徑活性的測定

---血清總補體活性（CH50）測定二、補體旁路途徑的溶血活性

---（AP-H50）測定第二節補體測定31一、血清總補體活性測定（一）50%綿羊紅細胞溶血法（CH50）1.實驗原理補體最主要的活性是溶細胞作用，這種活性很容易通過溶血反應進行檢測。在一個適當的、穩定的反應系統中，溶血反應對補體的劑量依賴呈一個特殊的S形曲線。一、血清總補體活性測定32溶血程度與補體含量的關系溶血程度與補體含量的關系33

在輕微溶血和接近完全溶血時，補體量的變化不能使溶血程度有顯著改變，即溶血對補體量的變化不敏感。在半溶血（50％溶血）上下時曲線最陡，即使補體含量僅有較小變動時，溶血程度也會發生較大的改變，也就是說對補體量的變化非常敏感。故采用50％溶血作為終點指標要比100％溶血敏感得多，這一方法稱為補體50％溶血(complementhemolysis50％)，簡稱為CH50。在輕微溶血和接近完全溶血時，補體量的變化不能使溶血程度有342.技術要點致敏SRBC：稀釋血清:配制50%溶血標準管：加樣:結果測定:2.技術要點35致敏SRBC：2單位溶血素與2%SRBC懸液等量混勻，37℃水浴10min。致敏過程中不時搖動使紅細胞保持均勻混懸狀。

致敏SRBC：36稀釋血清:取新鮮血清稀釋。靜脈血室溫凝固1h，不宜放冰箱凝固，因為補體在0℃發生冷激活。然后4℃離心分離血清，避免溶血。0.2ml血清加入3.8ml稀釋緩沖液，混勻，即為1∶20血清。

稀釋血清:37配制50％溶血標準管：2%SRBC懸液0.5m1，加入蒸餾水2.0ml，混勻，使SRBC全部溶解；加入1.8%NaCl2m1，使溶液為等滲；再加入2%SRBC懸液0.5m1，混勻，即為50%溶血狀態；取該溶液2.5m1，與試驗管一起溫育，即為50％溶血標準管。配制50％溶血標準管：38免疫學檢驗-6-補體參與的反應課件39

結果測定:2500r/min離心5min，觀察結果，選擇溶血程度與標準管相近的兩管在分光光度計上分別讀取吸光度，以最接近標準管的那一管定為最高有效反應管，取其血清用量、稀釋倍數代入下列公式，求得CH50的測定值（單位U）。

血清總補體活性（U/ml）＝

×稀釋倍數

1血清用量結果測定:403.方法評價

CH50試驗測定的是經典途徑總補體溶血活性，所

反應的是補體9種成分的綜合水平。方法簡便、快速，但敏感性低。影響因素：補體的溶血活性除與試驗中反應體積成反比外，還與反應所用緩沖液的pH、離子強度、鈣鎂濃度、SRBC數量和反應溫度有一定關系。3.方法評價414.臨床意義

總補體活性的參考范圍為50～100U/mlCH50增高見于：急性炎癥、組織損傷、惡性腫瘤等。CH50降低見于：系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎和強直性脊柱炎、急性腎小球腎炎等。4.臨床意義總補體活性的參考范圍為50～100U/ml42（二）脂質體均相免疫溶破法原理脂質體（liposome）內包有熒光素、有色染料或酶等。表面經修飾可與抗原或抗體偶聯，成為致敏脂質體，在與相應抗體或抗原結合后，可經經典途徑激活補體，導致脂質體溶破，釋放出內容物的量與補體活性成正相關。方法評價簡便、快速、準確、血清用量少，適用于自動分析儀測定，易于標準化。（二）脂質體均相免疫溶破法43免疫學檢驗-6-補體參與的反應課件44二、補體旁路途徑溶血活性(AP-H50)測定（一）原理用乙二醇雙氨基四乙酸（EGTA）螯合樣品中的Ca2+，封閉C1，阻斷補體經典活化途徑。EGTA結合Mg2+能力很弱，加入可直接激活血清中B因子的兔紅細胞，引起補體旁路途徑活化，致使兔紅細胞損傷而發生溶血。規定反應時間內，溶血程度與旁路激活的補體活性呈正相關。溶血率與補體旁路溶血活性的關系類似于CH50，故以50％兔紅細胞溶血為判斷終點。

二、補體旁路途徑溶血活性(AP-H50)測定452.技術要點0.5%兔紅細胞懸液：用EGTA配制.配制50%溶血標準管：用兔紅細胞.稀釋血清:用EGTA作1:4稀釋加樣:結果測定:2.技術要點46免疫學檢驗-6-補體參與的反應課件47

結果測定:以出現50%溶血的待檢血清最小含量為判斷終點，取其血清用量代入下列公式，求得AP-H50的測定值（單位U）。

AP-H50活性（U/ml）＝

×4

1血清用量結果測定:483.方法評價測定的是旁路途徑溶血活性。方法簡便、快速，但敏感性低。兔紅細胞易溶血,重復性較差。3.方法評價494.臨床意義

AP-H50活性的參考范圍為21.7±5.4U/mlAP-H50增高見于：腎病綜合征、慢性腎炎、腫瘤、某些自身免疫病和感染等。

AP-H50降低見于：肝硬變、慢性活動性肝炎、急性腎炎等。4.臨床意義AP-H50活性的參考范圍為21.7±5.4U50

第三節單個補體成分的測定一、免疫溶血法檢測某個補體成分的功能和活性。

選用先天性缺乏某一補體成分的動物或人血清。檢測補體經典途徑激活常用CH50、C2、C3和C4。檢測旁路途徑激活常用AP-H50、B因子和P因子。二、免疫化學法測定其蛋白含量。有單向免疫擴散、火箭免疫電泳和免疫比濁法。