氯化兩面針堿對(duì)多藥耐藥細(xì)胞的抗癌作用

多藥殘留是腫瘤化療失敗的主要原因之一。克服多藥多葉藥物是治療腫瘤的一個(gè)難題。近年來,國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了多種多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑,但均因靶點(diǎn)單一、體內(nèi)逆轉(zhuǎn)效率低及毒副作用大而難以應(yīng)用于臨床。因此,在進(jìn)一步尋找高效、低毒的MDR逆轉(zhuǎn)劑的同時(shí),從豐富的中草藥資源中篩選對(duì)MDR細(xì)胞敏感的抗癌活性成分成為克服多藥耐藥的另一條重要途徑。氯化兩面針堿是我國學(xué)者黃治勛等從兩面針[Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.]植物的根中分離到的具有抗腫瘤活性的生物堿。據(jù)報(bào)道,其體外對(duì)Lewis肺癌、人鼻咽癌、肝癌和慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞等有殺傷活性,對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。我們研究發(fā)現(xiàn),氯化兩面針堿對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)增殖具有抑制作用(待發(fā)表),本研究觀察了其對(duì)人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞KBV200生長的抑制作用。1材料和方法1.1基因組織及儀器氯化兩面針堿購自中國藥品生物制品檢定所(批號(hào):110848-20001,純度>98%);胰蛋白酶和噻唑藍(lán)(MTT)購于美國Amresco公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司;Hoechst33258購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)ELISA試劑盒購自奧地利MedSystemsDiagnosticsGmbH公司;RNase購自美國MBI公司;碘化丙啶(propidiumiodide,PI)購自美國Sigma公司。Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品,使用MulticycleAV分析軟件;Model-450酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀:美國Bio-Rad公司;LeicaDMR+Q550熒光顯微鏡:德國萊卡公司;JEM-1200EX型透射電鏡:日本電子公司;CO2培養(yǎng)箱:美國FormaScientificInc公司。1.2血清rpmi-1330的培養(yǎng)人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞株KBV200購自中科院細(xì)胞庫,置37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中,用含10%新生牛血清以及青、鏈霉素各100kU·L-1的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)加長春新堿(vincristine,VCR)至200nmol·L-1以維持其多藥耐藥性,實(shí)驗(yàn)前停藥1周。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,0.25%胰蛋白酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.3細(xì)胞抑制濃度mic將氯化兩面針堿用二甲亞砜(DMSO)助溶,用基礎(chǔ)培養(yǎng)基依次倍比稀釋成5個(gè)濃度的母液,調(diào)整各濃度中DMSO含量至一致。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔0.19mL(約3×103細(xì)胞)接種于96孔板培養(yǎng)12h,待細(xì)胞貼壁后,分別加入不同濃度的氯化兩面針堿10μL,使其終濃度分別為0.75,1.5,3,6和12mg·L-1,對(duì)照組加含0.5%DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,孵育48h每孔加入10μLMTT(5g·L-1),繼續(xù)培養(yǎng)4h后傾去培養(yǎng)液,每孔加入DMSO0.15mL,平板振蕩器振蕩5min,充分溶解藍(lán)紫色顆粒,空白孔調(diào)零,用酶標(biāo)儀以570nm和630nm雙波長測(cè)定吸光度(A)值,用logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算±s。1.4細(xì)胞氧基化反應(yīng)Hoechst33258為透膜性熒光染料,可與細(xì)胞核DNA結(jié)合,故正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞均可被Hoechst33258著色,但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色較淺;而凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞體積縮小,染色質(zhì)固縮濃集而呈濃染致密的亮藍(lán)色顆粒狀熒光。氯化兩面針堿0,3,6和9mg·L-1與細(xì)胞作用48h后,收集細(xì)胞,用PBS洗滌,按文獻(xiàn)方法進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下每組觀察3張片子,每片觀察3個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下100個(gè)細(xì)胞的凋亡率。1.5用女性法檢測(cè)細(xì)胞cappose3的含量氯化兩面針堿6mg·L-1預(yù)處理細(xì)胞48h,按照ELISA試劑盒說明書制備樣品并測(cè)定caspase3含量。1.6流式細(xì)胞周期檢測(cè)氯化兩面針堿3mg·L-1與細(xì)胞作用0,12,24,和48h,用PBS沖洗細(xì)胞2次,按文獻(xiàn)方法染色,用流式細(xì)胞儀檢測(cè),MultiCycleAV軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析,計(jì)算各期細(xì)胞百分率。1.7統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,組間比較使用SPSS軟件(13.0)進(jìn)行單因素方差分析和Dunnettt比較。2結(jié)果2.1氯化藥物對(duì)膜免疫藥物細(xì)胞生長的影響如圖1所示,氯化兩面針堿與KBV200細(xì)胞作用48h,隨著藥物濃度增加,細(xì)胞存活率降低,呈濃度依賴性抑制作用(r=-0.956,P<0.01),IC50值為(2.43±0.19)mg·L-1,提示氯化兩面針堿體外對(duì)KBV200細(xì)胞生長具有抑制作用。2.2胞核型熒光:背景下我國我國第一大的熒光,無染或者微細(xì)胞凋亡如圖2所示,空白對(duì)照組細(xì)胞胞核染色淺,輪廓不清。經(jīng)氯化兩面針堿(3,6和9mg·L-1)作用48h后,各組未凋亡細(xì)胞胞核呈現(xiàn)彌漫均勻的淺綠色熒光,形態(tài)均一,隱約可見;而凋亡細(xì)胞皺縮變小,大小不一,胞核或胞質(zhì)內(nèi)濃染致密的亮藍(lán)色熒光顆粒清晰可見,部分細(xì)胞核碎裂。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,氯化兩面針堿3,6和9mg·L-1組細(xì)胞凋亡率依次為(2.3±0.7)%,(14.0±2.5)%和(8.3±2.2)%,與對(duì)照組(1.6±0.4)%比較,6和9mg·L-1組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01,n=3),提示較高濃度的氯化兩面針堿體外可誘導(dǎo)KBV200細(xì)胞凋亡。2.3h前后細(xì)胞caspase3含量的比較氯化兩面針堿6mg·L-1與KBV200細(xì)胞作用48h后,細(xì)胞caspase3含量為(1.19±0.03)mg·L-1,與對(duì)照組(1.01±0.02)mg·L-1比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,n=6)。2.4兩組患者顯增加的比例,除雜的2.氯化兩面針堿3mg·L-1與KBV200細(xì)胞作用12h后(圖3),G2/M期細(xì)胞比例明顯增加,由對(duì)照組的(12.4±5.3)%增加到(50.7±4.5)%(P<0.01,n=6)。作用24和48h時(shí),G2/M期細(xì)胞比例達(dá)(73.0±1.9)%和(75.1±3.6)%(P<0.01,n=6),表明氯化兩面針堿對(duì)KBV200細(xì)胞有明顯的G2/M期阻滯效應(yīng)。3氯化兩面針堿對(duì)治療創(chuàng)傷劑-膜誘導(dǎo)的作用據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),每年約49萬例癌癥患者死亡,其中61%與腫瘤內(nèi)在性耐藥有關(guān),33%與腫瘤獲得性耐藥有關(guān)。因此,研究克服腫瘤多藥耐藥具有重要的臨床意義。KBV200細(xì)胞是以對(duì)VCR敏感的KB細(xì)胞為親本,通過誘變劑甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate)刺激,然后在培養(yǎng)液中加入濃度遞增的VCR誘導(dǎo)而得。在VCR200nmol·L-1時(shí)生長良好,對(duì)VCR耐藥約是KB細(xì)胞的100倍,其耐藥機(jī)制主要與P-糖蛋白過度表達(dá)有關(guān),是研究多藥耐藥的經(jīng)典細(xì)胞株。本研究結(jié)果表明,氯化兩面針堿與KBV200細(xì)胞作用48h,隨著藥物濃度增加,細(xì)胞存活率降低,呈濃度依賴性抑制作用,提示氯化兩面針堿在體外對(duì)耐藥細(xì)胞KBV200生長具有抑制作用。細(xì)胞周期阻滯和凋亡是許多抗腫瘤藥物的重要作用途徑。Caspase家族是一大類凋亡調(diào)節(jié)基因,其中caspase3在多種刺激因子觸發(fā)的凋亡程序中起最后的樞紐作用,由它激活核酸內(nèi)切酶降解DNA,導(dǎo)致凋亡,是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶。為此,本研究進(jìn)一步觀察了氯化兩面針堿對(duì)KBV200細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明,氯化兩面針堿(6和9mg·L-1)與KBV200細(xì)胞作用48h,細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高,在6mg·L-1時(shí)可使KBV200細(xì)胞caspase3含量升高,由此表明氯化兩面針堿對(duì)KBV200細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。氯化兩面針堿在3mg·L-1時(shí)與KBV200細(xì)胞作用12,24和48h具有明顯的G2/M期阻滯效應(yīng),但代表細(xì)胞凋亡的亞二倍體峰卻在各時(shí)間點(diǎn)均未檢出,該結(jié)果與用Hoec