第六章

生物催化劑的修飾與改造1酶的結構和功能酶蛋白的結構特征酶蛋白和其他蛋白質一樣，由20種基本氨基酸按一定的順序排列，此即為酶蛋白的一級結構。具有一定結構的多肽鏈以一定規則的氫鍵形成-螺旋，-折疊，-轉角和自由盤繞等為二級結構。這些二級結構單元進一步盤曲折疊，形成環狀分子，即三級結構。若酶蛋白具有四級結構，則必須具有兩條或多條肽鏈。球狀分子表面以疏水作用力、范德華力、氫鍵等非共價鍵互相連接起來，形成完整的酶分子。這些組成四級結構最小單位的肽鍵稱為亞基。2全酶輔酶或輔基酶蛋白必需殘基活性部位結構殘基（活性部位外的必需殘基）非貢獻殘基接觸殘基輔助殘基催化基團底物結合基團大多數酶是結合蛋白質。除了多肽鏈組分外，還含有非蛋白組分，他們通常是各種低分子的熱穩定性物質或離子（輔因子）。酶蛋白+輔因子=全酶3酶蛋白分子水平的改造基于序列的合理化設計（sequentialrationaldesign）,如化學修飾、定點突變（site-directedmutagenesis）非合理設計（irrationaldesign），利用基因的可操作性，模擬自然界的演化進程。如定向進化（directedevolution）雜合進化（hybridevolution）4酶分子的研究：認識和改造認識酶，并利用各種生物化學、晶體學、光譜學等方法對天然酶或突變體進行研究，獲得酶分子特征、空間結構、結構和功能之間的關系，以及氨基酸殘基功能的信息。以此為根據，對酶分子進行改造合理設計不需要準確的酶分子結構信息，而通過隨即突變、基因重組、定向篩選等對酶進行改造非合理設計5生物催化劑的化學修飾酶分子修飾：酶蛋白分子的結構發生改變改變酶的某些特性和功能。廣義的說：蛋白質的修飾，通過化學基團的引入或除去—改變蛋白質的共價結構。酶分子的完整空間結構：賦予酶的生物催化功能和特性，另一方面，導致酶的穩定性差、活性不高。6酶分子的修飾目的人為的改變天然酶的某些性質：穩定性、創造天然酶所不具備的某些優良特性，擴大酶的應用范圍。酶修飾后：1）提高生物活性、2）增強在不良環境中的穩定性，3）新的催化能力。如：脂肪酶和蛋白酶被MPEG修飾后，可溶于有機溶劑，催化酯合成、酯交換、肽合成。如：a-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾成親水性更強的-NHCH2COOH后，抗不可逆熱失活的穩定性在60C可提高1000倍。如：對脂肪酶的CRL的非特異性化學修飾，大幅度提高立體選擇性。71、研究酶的空間結構2、確定氨基酸殘基的功能3、測定酶分子中某種氨基酸的數量化學修飾在酶結構與功能研究中的應用除了以上三方面外，在測定酶的氨基酸序列和研究變構酶時也能有不凡的表現。化學修飾在酶的結構和功能研究中的應用8酶蛋白修飾的方法物理修飾和化學修飾：主鏈修飾側鏈基團修飾組成單位置換修飾金屬離子置換修飾大分子結合修飾親和修飾910生物大分子酶，組成單位主要是氨基酸和核苷酸。AA通過肽鍵連接成肽鏈，在通過盤繞折疊形成完成的空間結構。蛋白類酶的主鏈-肽鏈，是酶分子結構的基礎。主鏈一旦改變，酶的結構和特性將隨之發生改變。主鏈的切斷和連接-主鏈修飾：切斷-酶原的活化，連接-1個酶分子上具有兩種或多種催化活性的多酶融合體。側鏈的修飾：羧基的化學修飾、氨基、精氨酸胍基、巰基、組氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、酪氨酸殘基和脂肪羥基、甲硫氨酸甲硫基的化學修飾11酶蛋白的固定化方法修飾固定化可通過空間障礙、分配或擴散限制等效應影響酶的穩定性。空間障礙使得其他大分子難于與酶作用，載體上的酶能抵抗蛋白水解酶的降解，固定化后也能抑制某些化學失活。固定化后，微環境和游離酶有所改變，影響最始pH、底物專一性和動力學常數。如陽離子resin載體，最適pH升高；陰離子resin載體的固定化，最適pH偏低。凝膠包埋：外部與內部傳質都存在擴散效應，可以明顯使酶更加穩定。如：a-胰凝乳蛋白酶包埋在PAA和PAGE凝膠中，60C時，提高1000倍。12酶蛋白的反膠束修飾提供包埋酶的口袋，使酶微膠囊化，保護酶，使其在不利環境下有效發揮作用。提高酶活，改變專一性。如：游離脂肪酶在油脂甲醇解反應體系，反膠束體系，活力、穩定性提高5倍。13大分子修飾劑的化學修飾非共價修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調節酶的微環境來保護酶的活力。另一類添加物就是蛋白質。蛋白質分子之間相互作用時，其表面區域內排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩定性也就增加了。14用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍共價修飾15大分子修飾(共價)的過程修飾劑的選擇：大分子結合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據酶分子的結構和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：修飾劑含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應而結合在一起。在使用之前一般需要經過活化，然后才可以與酶分子的某側鏈基團進行反應。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。16PEG、單甲氧基聚乙二醇（MPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）、葡聚糖、CD、羧甲基纖維素等可溶性分子。分子量500-20000的PEG類修飾劑應用最廣，PEG分子末端有2個-OH，兩親分子，無毒，沒有免疫原性。如：辣根過氧化物酶用MPEG共價修飾后，極端pH下抗變性能力提高，耐熱性提高。如：MPEG修飾的過氧化氫酶在有機溶劑中，溶解性和酶活提高，耐熱性提高，在三氯乙烷中酶活提高200倍，水溶液中酶活力提高15-20倍。不足：影響酶活性中心，必須事先了解酶活性部位的結構、或采取措施保護酶活性部位。17小分子修飾劑的化學修飾小分子化合物對活性部位或活性部位之外的側鏈基團化學修飾。包括：酶分子的表面化學修飾、內部修飾、非催化活性基團修飾、催化活性基團的修飾、酶蛋白的主鏈修飾、輔因子相關的修飾。共價修飾蛋白質達到穩定化的原因：1)獲得不同于天然蛋白質構象的更穩定的構象；2）修飾“關鍵功能基團”而達到穩定化；3）引入了新功能基團可以形成附加的氫鍵和鹽健；4）非極性試劑修飾加強蛋白質中的疏水相互作用；5）蛋白質表面基團的親水化。18側鏈基團修飾酶蛋白的側鏈基團是指組成蛋白質的氨基酸殘基上的功能團。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團的修飾可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結構的形成和穩定有重要作用。側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的特性和功能。經常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp19氨基修飾

修飾劑主要有：亞硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯、O－甲基異脲順丁烯二酸酐等。1乙酸酐，2TNBS,3DNFB，4碘代乙酸，5還原烷基化，6DNS20羧基修飾

羧基修飾劑：碳二亞胺重氮基乙酸鹽、乙醇－鹽酸試劑、異惡唑鹽。羧基修飾劑與側鏈的羧基進行酯化、酰基化等反應，使蛋白質的空間構象發生改變碳二亞胺是酶分子羧基修飾最普遍采用的修飾劑。用此修飾法可以定量測定酶分子中羧基的數目1碳化二亞胺，2硼氟化三甲鋅鹽，3甲醇-HCl21巰基修飾常用的巰基修飾劑：酰化劑烷基化劑、馬來酰亞胺、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉。1DTNB,24,4’-二硫二吡啶(4-PDS),3對氯汞苯甲酸(PMB)22胍基修飾

采用二羰基化合物與胍基反應生成穩定的雜環，它們可以在中性或者弱堿性的條件下，與精氨酸殘基上的胍基反應，生成穩定的雜環類化合物。胍基修飾劑的二羰基化合物：丁二酮、1,2-環己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。1丁二酮/硼酸鹽,21,2-環己二酮,3苯乙二醛23酚基修飾

◆蛋白質分子的酪氨酸殘基上含有酚基。酚基的修飾包括酚羥基的修飾和苯環上的取代修飾。碘化法、硝化法、琥珀酰化法四硝基甲烷（TNM）可以高度專一地對酚羥基進行修飾。24咪唑基修飾常用修飾劑有：碘乙酸，焦碳酸二乙酯等。組氨酸殘基發生改變1焦碳酸二乙酯，2碘代乙酸，3碘化反應25吲哚基修飾修飾劑:N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）、2-羥基-5-硝基芐溴（HNBB）4-硝基苯硫氯。色氨酸含有吲哚基26分子內交聯修飾含有雙功能基團的化合物（雙功能試劑），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距較近的兩個側鏈基團之間形成共價交聯，從而提高酶的穩定性根據其功能基團的特點分為：同型雙功能基團化合物和異型雙功能基團化合物。同型雙功能基團化合物兩端具有相同的功能基團，例如，己二胺[H2N-(CH2)6－NH2]兩端都含有氨基，可以與酶分子中的羧基形成酰胺鍵,；戊二醛[OHC-(CH2)3-CHO]的兩端都含有醛基等，可與酶分子的氨基形成酰胺鍵或者與羥基反應形成酯鍵。異型雙功能基團化合物的兩端所含的功能基團不相同，可以與酶分子上不同的側鏈基團反應。如，一端與酶分子的氨基作用，另一端與酶分子的巰基或羧基作用等。27酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，在肽鏈的限定位點進行水解，使酶的空間結構發生某些精細的改變，從而改變酶的特性和功能的方法，稱為肽鏈有限水修飾。有些生物體可以生物合成不顯示酶催化活性的酶原,利用具有高度專一性的蛋白酶對其進行肽鏈有限水解修飾,顯示出酶的催化活性或提高酶活力。28胃蛋白酶原的激活29酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點：不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發生某些變化和重排，使酶分子的空間構象改變。如：高壓方法處理纖維素酶，最適溫度降低，在30-40C的條件下，高壓修飾的纖維素酶比天然酶活力提高10%。如：鹽酸胍使胰蛋白酶的原有空間構象破環，通過透析除去變性劑后，在不同溫度下，使酶重新構建新的空間構象：20C時重新構建的酶穩定性基本不變，在50C時構建的酶穩定性提高5倍。30酶修飾后的性質變化熱穩定性：一般來說，熱穩定性有較大的提高。抗原性：比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩定性。半衰期：一般在體內的半衰期得到有效延長。由于酶分子經修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩定性，從而延長了在體內的半衰期。最適pH：大部分酶經化學修飾后，酶的最適pH發生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環境，在臨床應用上有較大意義。Km的變化：大多數酶經修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經修飾后，Km值變大。31酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復或者部分恢復。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩定性。32α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)酶活提高：α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+）：發酵生產、保存和應用中，添加一定量Ca，有利提高和穩定其活力；Zn型蛋白酶（Zn—Ca置換）--Ca型蛋白酶，活力提高30%。穩定的改變：Fe型SOD置換成Mn-SOD，其對過氧化氫的穩定性顯著提高，對疊氮鈉（NaN3）的敏感性顯著降低。動力學特性改變：酰基化氨基酸水解酶活性中心的Zn被Co置換后，N-氯-乙酰丙氨酸水解最適pH8.5降到7，Km增大，33金屬離子置換修飾的過程

a.酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經過分離純化，除去雜質，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結合，除去多余的置換離子，就可以得到經過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結構中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。34酶分子修飾的基本要求和條件對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩定性熱穩定性、酸堿穩定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數等。35酶分子修飾的條件修飾反應盡可能在酶穩定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態。由于它們的解離狀態不同，反應性能也不同。（2）修飾反應的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。（3）反應體系中酶與修飾劑的比例

36酶的組成單位置換修飾酶分子的基本組成單位：氨基酸、核苷酸，他們是酶的化學結構和空間結構的基礎，微小的改變引起酶的特性和功能。酶分子肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸—氨基酸置換修飾。酶RNA的基本組成核苷酸，核苷酸鏈上上某一個核苷酸換成另一個核苷酸—核苷酸置換修飾。37氨基酸或核苷酸的化學置換修飾例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質和多肽的水解能力，卻出現了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復雜，難以工業化生產。38核苷酸定位突變技術置換修飾例：L-19IVS活性中心上堿基的改變引起其底物專一性的變化39定位突變技術用于酶分子修飾的主要過程定點突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發展起來的一種基因操作技術。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。是蛋白質工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術。在DNA水平改變已有蛋白質的編碼序列的基本方法，在已知的DNA序列中取代、插入或刪除特定的核苷酸，從而改變酶結構中的個別AA殘基。--理性分子設計①新的酶分子結構的設計②突變基因堿基序列的確定③突變基因的獲得④新酶的獲得40①新的酶分子結構的設計根據已知酶RNA或酶蛋白的化學機構和空間結構及特性，特別是根據酶在催化活性、穩定性、專一性等存在的問題，設計出想獲得的新酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，確定想置換的核苷酸或氨基酸及其位置。41②突變基因堿基序列的確定根據想獲得酶蛋白的氨基酸排列次序，對照遺傳密碼，確定其對應的mRNA上的核苷酸序列，再依據堿基互補原則，確定此mRNA所對應的突變基因上的堿基序列，并確定需要置換的剪輯及其位置。42③突變基因的獲得根據突變基因的剪輯序列及其需要置換的堿基位置，首先用DNA合成儀合成有1-2個堿基被置換了的寡核苷酸，再以此為引物通過PCR擴增獲得大量的突變基因（寡核苷酸誘導的定位突變）④新酶的獲得上述定點突變獲得的突變基因體外重組，插入到適宜的基因載體中，然后進行轉化、轉導、介導、基因槍、顯微注射等技術，轉入到適宜的宿主細胞，再在適宜的條件下進行表達，獲得經過修飾的新酶。4344定點突變的局限基于酶蛋白的空間結構蛋白質結構與功能間關系的復雜性蛋白質序列如何決定高級結構、高級結構如何影響酶特性，如：蛋白質序列如何影響蛋白質的異源表達、高級結構的催化活力如何受非天然環境的影響等。成功率低451、某些修飾劑對某一氨基酸側鏈的化學修飾專一性是相對的，很少有對某一氨基酸側鏈絕對專一的化學修飾劑；2、化學修飾后的酶構象或多或少都有一些改變，這種構象的變化將妨礙對修飾結果的解釋；3、酶的化學修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側鏈上進行，目前還不能用化學修飾的方法研究其他氨基酸殘基在酶結構與功能關系中的作用；4、酶化學修飾的結果對于研究酶結構與功能的關系能提供一些信息，但尚缺乏準確性和系統性。蛋白質化學修飾的局限性46生物催化劑的定向進化

dierectedevolution非理性設計irrationaldesign,不需要事先了解酶的空間結構和催化機制，人為地創造特殊的計劃條件，模擬自然進化機制（隨即突變、基因重組、自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（篩選）出所需要的性能優良的酶。酶分子定向進化是從一個或多個已經存在的親本酶出發，經過基因的突變和重組，構造一個人工突變酶庫，通過篩選最終獲得預先期望的具有某些特性的進化酶。47定向進化原理：對單一酶分子基因進行定向進化為例，在待進化酶基因的PCR擴增反應中，利用TaqDNA多聚酶不具有3’-5’校對功能，并控制突變庫的大小使其與特定的篩選容量相適合。選擇適當條件以較低的比率向目的基因中隨機引入突變，進行正定向突變間的隨機組合以構建突變庫，憑借定向的選擇（或篩選）方法，選出所需要性質的優化酶，從而排除其他突變體。48定向進化的基本規則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化的目的：在短時間內，通過反復的突變/復制/篩選/選擇過程，獲取你想篩選的得以提高的突變酶，即定向進化=隨機突變+選擇。創始人：Stemer和Arnold，認為定向進化：是物種進行選擇的一個高技術版本，是在分子水平上的繁育，研究的對象不是整個有機體，而是特定的基因或蛋白質。49定向進化的一般過程：不僅能夠改造單個蛋白質分子，而且可以改造整個生物合成和生物降解途徑。（1）基因的選擇：選擇編碼所需蛋白質的DNA序列。（2）突變或重組：通過易錯PCR引入隨即突變或DNAShuffling等方法增加基因序列的多樣性。（3）突變基因文庫的構建：將獲得的突變重組基因插入到表達載體中的構建突變庫。（4）突變體酶的表達：將載體轉入受體細胞表達變異酶。（5）目的酶的鑒定：利用篩選和選擇方法確定有益的特性克隆。（6）分離改良基因并重復上述過程，直至獲得所需性質的蛋白質。50酶分子的體外定向進化原理51定向進化策略ErrorpronePCR易錯PCRDNAshufflingDNA改組exonshuffling外顯子改組Hybridenzyme雜合酶Random-prominginvitrorecombinationPCR體外隨機引發重組Staggerextensionprocessstep交錯延伸Random-site-directedmutagenesisinvitro隨機定向突變52易錯PCR技術為代表的無性進化無性突變是向單一酶分子基因內隨機引入突變，制造突變酶庫以便篩選。主要的手段包括易錯PCR，盒式誘變，隨機/定位誘變等。易錯PCR是在采用Taq酶進行PCR擴增目的基因時，通過調整反應條件，例如：提高Mg2+離子濃度，加入Mn2+離子，改變體系中四種dNTP的濃度等，然后選擇或篩選需要的突變體。其中關鍵之處在于突變率需要仔細調控。53通常，經過一次突變的基因很難獲得滿意的結果，由此發展出連續易錯PCR策略，即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續反應的進行隨機誘變，使每一次獲得的小突變基因作為下一次PCR