實驗二酶聯免疫吸附試驗實驗目的了解ELISA反應原理、類型及特點掌握直接ELISA操作步驟通過實驗認識抗體的雙重性實驗原理抗原或抗體能物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附后的抗原或抗體仍保持其免疫學活性。酶可與抗體通過共價鍵連接而形成酶標記抗體，這種結合作用并不影響抗體的免疫學活性和酶的催化活性。酶標抗體中的酶可催化無色底物形成有色產物，酶標抗體與相應抗原或抗體結合后，可根據有無顏色反應來判定是否有免疫反應發生，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比，因此，可以按底物顯色的程度來顯示試驗結果。實驗器材及試劑3.1器材微量移液器，酶標儀、洗板機、96孔酶標板、PHSJ-4A型pH計等3.2試劑顯色劑(TMB)、兔抗雞IgG-HRP、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、標準品雞IgG3.3各種緩沖液包被液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)0.lMNa2C031.59g,0.1MNaHCO32.93g,加DDH20(DDW)至1L，用精密pH計調整pH值到9.6；封閉液3%BSA,3gBSA溶于100mLPBS中，調整PH7.4；洗滌及稀釋液PBST和PBS(PH7.4)0.01mol/LPBS緩沖液NaCl8.014g,KCL0.201g,Na2HPO4?12H2O3.581gKH2PO40.272g溶于1000mL蒸餾水，調整pH至7.2,高溫高壓滅菌。1LPBS(pH7.2)中加入0.5mLTween-20配制成PBST。封閉液稱取0.1gBSA溶于100mLPBST中;底物Buffer稱取7.16gNa2HPO4?12H2O溶于100mL去離子水中，量取25.7mL于100mL容量瓶中；再稱取2.1gC6H8O7?H2O溶于100mL去離子水中，量取24.3mL于容量瓶中；再加約50mL去離子水定容，并調pH值至5.0。TMB工作液底物A：TMB40mg，無水乙醇或DMSO10mL；底物B：250pL的A溶液，加10mL底物Buffer，臨用加20pLH2O2；最好現用現配。SubstrateA,B液必須4°C，避光保存。終止液2MH2SO4:濃H2SO420ml，加水至180mL；酶標抗體兔抗雞IgG-HRP，用PBST稀釋；4笆保存30d；操作步驟抗原包被在酶標板上包被稀釋好的標準雞IgG，每孔加100pL，4C，靜置包被過夜(17h)；X1600(即濃度為6.25口g/mL)X3200(3.125pg/mL)X6400(1.562pg/mL)洗滌PBST洗板3次，每孔加250pL,每次3min；最后一次丟棄孔中溶液后在濾紙上輕輕拍打，除去孔中殘留溶液；封閉加3%BSA,每孔250pL,37°C溫育2h；洗滌PBST洗板3次，每孔250pL,每次3min，同上；加酶標抗體用PBST稀釋酶標抗體至最適稀釋度(X500)，每孔加入100pL，37C溫育1h；洗滌PBST洗板3次，250pL每孔，每次3min；顯色每孔100pL，37C放置30min；終止反應于各反應孔中加入2M硫酸50以L結果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、"-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于45