鈍頂螺旋藻多糖sevage法除蛋白工藝研究

糖是一種重要的自然活性成分。根據(jù)大量研究，添加糖作為可以顯著提高動物的免疫功能，促進免疫器官的發(fā)育，激活阻力和激活淋巴結(jié)，促進動物生長，降低動物死亡率。因此,多糖是一種可替代抗生素的、具有很大開發(fā)潛力的天然飼料添加劑,其在飼料中的應用將有利于提高動物生產(chǎn)的安全性。螺旋藻多糖是從螺旋藻體中提取的一種生物活性大分子,具有多種生物活性。大量研究表明,螺旋藻多糖具有顯著的抗病毒抗輻射抗突變等功能,能提高機體的細胞免疫功能和體液免疫功能,抑制癌細胞DNA的合成及增殖,減輕輻射所引起的遺傳損傷等。但是,有關(guān)藻多糖做為動物飼養(yǎng)過程中飼料免疫佐劑的研究還未見展開,目前,在飼料方面螺旋藻主要是作為優(yōu)質(zhì)的高蛋白精飼料,臺灣、泰國等生產(chǎn)的螺旋藻已廣泛用作海產(chǎn)動物如鮑魚、對蝦等養(yǎng)殖的精飼料,而且螺旋藻還可增加牛奶、雞蛋的產(chǎn)量。因此,螺旋藻多糖作為動物飼料免疫佐劑的研究就成了一項非常有意義的課題。但是,螺旋藻中蛋白質(zhì)含量高達60～70%,除蛋白就成了螺旋藻多糖制備過程中一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。目前,常用的除蛋白方法主要有蛋白酶水解法、Sevage法和三氯乙酸法、加熱濃縮法等。其中,Sevage法是去蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法,它具有操作簡便、試劑廉價、去除游離蛋白質(zhì)效果好等優(yōu)點。因此,本試驗采用單因素方法研究了不同影響因素對Sevage法脫除螺旋多糖蛋白質(zhì)效果的影響,并在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗方法確定了鈍頂螺旋藻多糖Savage法除蛋白的最佳工藝條件,以期為螺旋藻多糖作為免疫佐劑的研究與開發(fā)奠定除蛋白方面的理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1責任公司提供服務螺旋藻粉,由內(nèi)蒙古鄂爾多斯市蒙加力螺旋藻業(yè)有限責任公司提供。該公司生產(chǎn)過程中采用的藻種為來自非洲乍得湖的鈍頂螺旋藻(spirulina(Arthrospira)platensis)。1.2試劑與儀器98%的濃硫酸、苯酚、標準葡萄糖、考馬斯亮藍G-250、氯仿、正丁醇均為國產(chǎn)分析純試劑。B-220型恒溫水浴鍋,RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵,電熱恒溫水浴箱;GL-22M高速冷凍離心機。1.3提取多糖、蒸提取液、掃描液、蒸發(fā)液的制備將螺旋藻粉用適量單蒸水溶脹后經(jīng)反復凍融法破壁,然后用98%的工業(yè)酒精按1:8的比例(藻粉:酒精)65℃脫脂2次,抽濾后殘渣65℃烘干后按20:1的水料比80℃浸提8h,抽濾棄去殘渣后得多糖提取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至原體積的1/3備用。1.4多酚測定苯酚-硫酸法,標準曲線見圖1。1.5測定蛋白質(zhì)含量的測定考馬斯亮藍G-250比色法,標準曲線見圖2。1.6按最小二公式計算采用脫蛋白率和多糖損失率兩個指標綜合評價脫蛋白效果。脫蛋白率和多糖損失率分別按下面公式計算。脫蛋白率=(多糖提取液中蛋白質(zhì)的含量-除蛋白后溶液中蛋白質(zhì)的含量)/多糖提取液中蛋白質(zhì)的含量×100%多糖損失率=(多糖提取液中多糖的含量-除蛋白后上清液中多糖的含量)/多糖提取液中多糖的含量×100%1.7單因素試驗1.7.1不同抗菌劑體積比對螺釘多糖除蛋白效果的影響振搖時間30min,螺旋藻多糖提取液與Sevage試劑體積比為1:1,脫蛋白1次條件下,氯仿與正丁醇體積比分別為3:1、4:1和5:1時對螺旋藻多糖除蛋白效果的影響,試驗重復3次,取平均值。1.7.2sevage試劑用量對螺釘多糖除蛋白效果的影響氯仿與正丁醇體積比4:1,振搖時間30min,脫蛋白1次條件下,Sevage試劑分別為多糖溶液的1倍、2倍、3倍時對螺旋藻多糖除蛋白效果的影響,試驗重復3次,取平均值。1.7.3振搖時間對螺釘多糖除蛋白效果的影響氯仿與正丁醇體積比4:1,Sevage試劑添加量為多糖溶液的1倍,脫蛋白1次條件下,振搖時間20min、30min和40min對螺旋藻多糖除蛋白效果的影響,試驗重復3次,取平均值。1.7.4除蛋白添加量對除蛋白效果的影響振搖時間30min,氯仿與正丁醇體積比4:1,Sevage試劑添加量為多糖溶液的1倍條件下,除蛋白1次、2次、3次對除蛋白效果的影響,試驗重復3次,取平均值。1.8最佳工藝組合正交試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上,確定脫蛋白時間為20min,在此條件下選擇氯仿正丁醇體積比(A)、Sevage試劑添加量(B)、脫蛋白次數(shù)(C)3個因素進行正交試驗,正交表L9(33),每個因素三個水平,研究上述三種因素對螺旋藻多糖脫蛋白效果影響的交互作用,確定最佳工藝組合條件。每種組合3次重復,取平均值,試驗因素水平設(shè)計見表1。2結(jié)果與分析2.1正丁醇體積比5:1時蛋白脫除率及多糖損失率由圖3結(jié)果可以看出,隨氯仿濃度的升高,蛋白的脫除效果顯著提高,但多糖損失率卻改變不大。氯仿正丁醇體積比5:1時的蛋白脫除率和多糖損失率分別為34.7%和8%,較氯仿正丁醇體積比為3:1和4:1時的脫蛋白率分別提高了26.3%和19.5%,而多糖損失僅增加了4%和3.1%。方差分析結(jié)果表明,氯仿正丁醇體積比5:1時的脫蛋白率與3:1和4:1的相比差異均顯著(P<0.05)。2.2多糖損失率由圖4結(jié)果可見,隨著Sevage試劑添加量不斷加大,蛋白脫除率反而逐漸下降,而多糖損失率變化不大,且均低于10%。Sevage試劑的添加量是多糖提取液體積的1倍時脫蛋白效果最好,其蛋白脫除率為27.9%,分別較2倍、3倍添加量時高7.9%、21.6%,不同添加量的脫蛋白結(jié)果相比差異顯著(P<0.05)。2.3振搖時間延長圖5結(jié)果顯示,隨著振時間的加長,蛋白脫除率呈平緩上升趨勢,不同振搖時間相比差異較小;多糖損失率隨振搖時間加長變化較大。40min時的多糖損失率為18.8%,較20min和30min的分別升高了13.9%和11.7%,而脫蛋白率僅提高了3.7%和2.1%,方差分析結(jié)果表明,振40min時的脫蛋白率與20min和30min的相比差異不顯著,多糖損失率相比差異顯著(P<0.05)。2.4朱曉帶的報道結(jié)果由圖6可見,隨著蛋白脫除次數(shù)的增加,蛋白脫除率呈顯著上升趨勢,多糖損失率變化不大,且均低于10%,這與朱曉霞等(2007)的報道結(jié)果一致。脫蛋白次數(shù)為3時的蛋白脫除率和多糖損失率分別為45.2%,蛋白脫除率較1次、2次的分別提高了17.3%和14.7%,多糖損失率較1次、2次的分別增加了4.4%和1.0%。方差分析結(jié)果表明,脫蛋白次數(shù)為3時的蛋白脫除率與1次和2次的相比差異顯著(P<0.05),多糖損失率相比差異不顯著。2.5sevage試劑添加量表2正交試驗結(jié)果統(tǒng)計分析表明,根據(jù)R值大小,正交試驗中三個影響因素對Sevage法除蛋白效果影響的大小依次為A>C>B,即氯仿正丁醇體積比>脫蛋白次數(shù)>Sevage試劑添加量,構(gòu)成Sevage試劑的氯仿正丁醇體積比是影響鈍頂螺旋藻多糖脫蛋白效果的主導因子。根據(jù)K值大小,螺旋藻多糖Sevage法除蛋白的最佳工藝條件為A2B2C2,即脫蛋白時間為20min條件下,氯仿正丁醇體積比4:1,Sevage試劑的添加量是多糖溶液的2倍,脫蛋白次數(shù)為2。3自由基苯磺酸鈉sevage脫蛋白法螺旋藻多糖提取液中蛋白質(zhì)含量較高,因此如何在盡量保持多糖有效成分的前提下,盡可能多的去除蛋白質(zhì)是一個非常有意義的研究內(nèi)容。本研究發(fā)現(xiàn),選用Sevage法脫除鈍頂螺旋藻多糖溶液中蛋白質(zhì),在短時間條件內(nèi)(≤20min)多糖損失率雖不高,但脫蛋白效果一般,脫蛋白率最高僅為45.2%。這可能與其除蛋白的機理有關(guān),Sevage法主要是去除游離蛋白質(zhì),而螺旋藻多糖中可能存在部分與多糖結(jié)合存在的糖蛋白,這可能是導致鈍頂螺旋藻多糖Sevage法除蛋白效果不是十分理想的原因所在。因此,建議在此研究基礎(chǔ)上,進一步選用其他方法就這項內(nèi)容繼續(xù)展開研究,以期為鈍頂螺旋藻多糖的制備篩選最合適的除蛋白方法。4振搖時間及地位本文單因素試驗結(jié)果表明,氯仿正丁醇體積比、Sevage試劑添加量、脫蛋白次數(shù)對鈍頂螺旋藻多糖脫蛋效果影響較顯著,選為正交試驗研究的三個因素;振搖時間對脫蛋白率影響較小,且隨著作用時間延長多糖損