圓二色光譜(簡稱CD)是應用最為廣泛的測定蛋白質二級構造較準確的方法。它可以在溶液狀態下測定，較接近其生理狀態。而且測定方法快速簡便，對構象變化靈敏，所以它是目前爭論蛋白質二級構造的主要手段之一，并已廣泛應用于蛋白質的構象爭論中。一．簡介圓二色譜是用于推斷非對稱分子的構型和構象的一種旋光光譜。光學活性物質對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸取系數(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圓二色性。假設以不同波長的平面偏振光的波長λ為橫坐標，以吸取系數之差Δε=εL-εR為縱坐標作圖，得到的圖譜即是圓二色光譜，簡稱CD吸取，就可以得到具有特征的圓二色光譜。由于εL≠εR，[θ]與Δε的關系為：[θ]=3300Δε。圓二色譜也可以摩爾橢圓度為縱坐標，以波長為橫坐標作圖。由于△ε有正值和負值之分，所以圓二色譜也有呈峰的正性圓二色譜和呈谷的負性圓二色譜。在紫外可見光區域測定圓二色譜與旋光譜，其目的是推斷有機化合物的構型和構象。二．樣品要求1、樣品必需保持確定的純度不含光吸取的雜質，溶劑必需在測定波長沒有吸取干擾;樣品能完全溶解在溶劑中,形成均一透亮的溶液。2、氮氣流量的把握3、緩沖液、溶劑要求與池子選擇：緩沖液和溶劑在配制溶液前要做單獨的檢查，看是否在測定波長范圍內有吸取干擾，看是否形成沉淀和膠狀；在蛋白質測量中，常常選擇透亮性極好的磷酸鹽作為緩沖體系。4 樣品濃度與池子選擇(光徑)的選擇和濃度的要求也不一樣。蛋白質CD光譜測量一般在相對較稀的溶液中進展。三．譜帶寬度選為1nm。對于高區分率測量，要用較窄的狹縫寬度，此時間電倍增管的電壓較高，譜的信噪比差。雖然對于正常測量最正確譜帶寬度是1~2率CD信號很CD一方面要設置較寬的狹縫。不過此時要特別留神，由于樣品在吸光度過高(A>2)的狀況下可能存在熒光或雜散光引起的CD光譜測試時也需要較大的狹縫寬度(一般要求2nm)。波長和樣品濃度總是應當特別注明的。當用壓片法或石蠟油研磨法進展固體粉末樣品測試時，要盡可能地研磨獲得細小均勻的樣品顆粒。承受石蠟油糊方法時，必需留意某些憎水有機化合物可能溶于石蠟油中，這時所得CD光譜在某種意義上應視為溶液CD法測試固體CDCD光譜儀檢測要求的同時，片越薄越透亮越好(但切忌破損)。在某些狀況下，壓片法不適用于手性抗衡陰離子存在下的固體誘導CD光譜的測定。使用壓片機須留意：①FW-42437.5MP，超過此極限簡潔損壞機器，請不要任憑加壓。8噸(12.5MP)即可，KBr(KCl)50mg時能獲得較光滑均勻的片膜。0，請馬上旋松油閥，檢查壓力表是否損壞。④機器放置一段時間未使用，在使用前可旋緊放油閥，加壓至15MP，再旋松放油閥。如此反復幾次，即可正常使用。⑤壓片完成后，請用棉花蘸取少量酒精將壓片模具和研缽洗干凈，置于紅外燈下烘干后再將壓片模具放回枯燥器中。壓片剩余的固體粉末和使用過的棉花倒入垃圾桶中。在紫外區進展光譜掃描時，J-810型CD光譜儀的耗氮量為：3L/min(190~400nm)；3~5L/min(185nm)；10因此當測定蛋白等樣品的遠紫外光譜時，必需增加氮氣的流量，以避開臭氧對紫外光產生的吸取干擾光譜的測定。對獵取抱負的溶液或固體CD譜圖的建議：CD光譜測試的條件(在給定波長范圍內有較強的CD信號和適宜的吸取值)。必需事先測定手性樣品的UV-Vis吸取光譜(溶液或固體漫反射)，推想CD譜峰的可能位置和選擇適宜的制樣濃度(對于溶液吸取光譜，A1)。(溶液、固體、單CD)。(見附表)光程(與測定UV-Vis光譜類似)。對于在紫外區測試的樣品建(≤0.5cm)為高純水或醇類溶劑(見附表)。⑤對固體樣品的壓片法測試，應視樣品的不同選用適宜百分比濃度及適宜的稀釋劑KBr、KClCsI等)研磨壓片后進展透射掃描。⑥選擇適當的測定參數(波長范圍、掃描速度、靈敏度和狹縫等)。CD光譜加以比較。CD光譜，CD信號的真偽和在定量的條件下相互印證其對映純度。三．原理光是橫電磁波，是一種在各個方向上振動的射線。其電場矢量E與磁場矢量H由于產生感光作用的主要是電場矢量，一般就將電場矢量作為光波的振動矢量。光波電場矢量與傳播方向所組成的平面稱為光波的振動面。假設此振動面不隨時間變化，這束光就稱為平面偏振光，其振動面即稱為偏振面。平面偏振光可分解為振幅、頻率一樣，旋轉方向相反的兩圓偏振光。其中電矢量以順時針方向旋轉的稱為右旋圓偏振光，其中以逆時針方向旋轉的稱為左旋圓偏振光。兩束振幅、頻率一樣，旋轉方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光。假設兩束偏振光的振幅(強度)不一樣,則合成的將是一束橢圓偏振光。,其光吸收的差值ΔA(=AL-AR)稱為該物質的圓二色性(circulardichroism,簡寫作CD)。圓二色性的存在使通過該物質傳播的平面偏振光變為橢圓偏振光,且只在發生吸取的波特長才能觀看到。依據Lambert-Beer定律可證明橢圓率近似地為：θ=0.576lc(εL-εR)=0.576lcΔε公式中l為介質厚度,c為光活性物質的濃度,εL及εR分別為物質對左旋及右旋圓偏θ(或Δε)值與波長λ之間的關系曲線,即圓二色光譜曲線。在此光譜曲線中,假設所測定的物質沒有特征吸取,則其Δε值很小,即得不到特征的圓二色光譜。當εL>εR時,得到的是一個正的圓二色光譜曲線,即被測物質為右旋,假設εL<εR,則得到一個負的圓二色光譜曲線,即被測物質為左旋。依據圓二色光譜法的原理和測試要求設計制成的儀器稱為圓二色光譜儀。目前圓二色光譜法及其儀器已廣泛應用,成為研究有機化合物的立體構型的一個重要方法。四．應用1.氨基酸的圓二色性可見光區：各種氨基酸都沒有光吸取。紫外光區：置于芳香族色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在蛋白質分子中，肽鏈的不同局部可分別形成α-螺旋、β-折疊、β-轉角等特定的立體構造。這些立體構造都是不185～240納米處有光吸取，因此它在這一波長范圍內有圓二色性。幾種不同的蛋白質立體構造所表現的橢圓值波長的變化曲線──圓二色譜是不同的。如(圖3)所示，α-螺旋的譜是雙負峰形的，β-折疊是單負峰形的，無規卷曲在波長很短的地方出單峰。蛋白質的圓二色譜是它們所含各種立體構造組分的圓二色譜的代數加和曲線。因此用這一波長范圍的圓二色譜可爭論蛋白質中各種立體構造的含量。蛋白質含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它們在240～350納米處有光吸取,當它們處于分子不對稱環