為什么會(huì)有“微笑”和“倒微笑”這樣的效果呢？（1） 〃微笑〃是因?yàn)槟愎嗄z的時(shí)候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。這種情況在較厚的凝膠以及垂直電泳時(shí)常常發(fā)生。“倒微笑“也稱“皺眉“現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象。（2） 書(shū)上說(shuō)出現(xiàn)“微笑”是因?yàn)檎麄€(gè)膠冷凝的不均勻，中間部分和兩端受熱不一樣而致成了“倒微笑”可能是因?yàn)閮啥说哪z凝的不好，加APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。（3） 樣品中鹽濃度過(guò)高？點(diǎn)樣量太多或每孔點(diǎn)樣量不均勻？電泳電壓不穩(wěn)定或過(guò)高？Western-blot制膠時(shí)好多泡泡怎么辦？（1） 首先，玻璃板一定要洗干凈，用洗潔凈洗，沖干凈后再用雙蒸水沖一，晾十。配膠的時(shí)候沿管壁緩緩加入各個(gè)成分，混勻的時(shí)候用于輕輕搖勻，如果用槍吹打時(shí)要緩慢且不要打到頭。（2） 配膠時(shí)混勻要輕，盡量不產(chǎn)生氣泡，上膠時(shí)要快，槍也不打到底。加完分離膠后用雙蒸水封，待其凝固。即使在上膠時(shí)液面上有氣泡，加水后也會(huì)浮上來(lái)。分離膠凝好后，倒掉里面的水，用吸水紙吸干，再加濃縮膠，迅速插梳子。（3） 倒膠的時(shí)候，用1ml的槍沿一側(cè)緩緩加入，不要打到頭，以免帶入氣泡！（4） 將膠在小燒杯里配好后，將電泳槽略微傾斜，將燒杯的嘴靠在玻璃邊緣，直接倒進(jìn)去，速度快，而且不容易產(chǎn)生氣泡，不妨試試。（5） 用雙蒸水封時(shí)建議用200ul的槍加水，這樣壓力小，以免把膠沖起來(lái)！（6） 國(guó)產(chǎn)的只能是緩慢加樣，別把氣泡加進(jìn)去。如果加進(jìn)去了，小心把整個(gè)板在桌上敲敲可以讓氣泡浮上來(lái)。（7） 分離膠中的氣泡與插梳子有關(guān)，垂直插容易產(chǎn)生氣泡，且不容意排除。將梳子傾斜5-10度插入，即使產(chǎn)生氣泡也可以也可以通過(guò)輕輕晃動(dòng)梳子使氣泡從一側(cè)逸出。（8） pinghw還有一個(gè)制膠起泡泡的原因，就是配膠的液體全部在四度存放，室溫制膠時(shí)由于溫差及凝膠聚合反應(yīng)放熱的關(guān)系，液體中微小的氣泡在凝固的凝膠中也會(huì)放大成可見(jiàn)的較大的泡泡，這種情況在夏天室溫較高時(shí)更容易出現(xiàn)。避免的方法是將制膠成分中除催化劑外的部分配置后放室溫下靜置一會(huì)兒，減小溫差后再加入催化劑制膠。atgc戰(zhàn)友的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，一些瑣碎的細(xì)節(jié)，但卻是實(shí)驗(yàn)中可能經(jīng)常遇到的令人頭痛的問(wèn)題？（1） 安裝好的制膠裝置，最好先用配置電泳緩沖液的水加滿檢驗(yàn)一下是否漏水，檢驗(yàn)確認(rèn)不漏水的裝置再用于制備凝膠。確認(rèn)不漏水后，倒出水，然后使其盡量流出，其實(shí)殘留的一點(diǎn)水并不影響結(jié)果，而且還會(huì)使電泳好的凝膠容易剝落下來(lái)。漏水的裝置制作的凝膠盡管可以使用，但它會(huì)造成電泳時(shí)候電流的分流，不但影響電流的效率，而且還會(huì)使部分加樣孔的條帶歪曲。（2） 制膠時(shí)最好最后加入入?，這樣可以避免偶然情況下不能馬上灌膠而導(dǎo)致膠的聚合，確認(rèn)所有的東西準(zhǔn)備齊全了，再最后加入AP，混合均勻后馬上灌膠。一定要使配膠的幾種溶液混合均勻，這是制得性質(zhì)均一的凝膠的前提。（3）進(jìn)口的AP可以很快使膠凝聚。所以，AP的用量最好比書(shū)上推薦的用量少點(diǎn)，這樣可以使膠的溶液慢慢聚合，這更有利于形成均勻一致的凝膠。也不會(huì)使操作變得手忙腳亂。（4） 有時(shí)候，梳子拉出以后，明明看不到加樣孔中有凝膠，但是就是加不進(jìn)去樣品，這主要是由于梳子與較大的那塊玻璃之間的縫隙中存留的制膠溶液凝聚后形成的很薄的一層凝膠造成的。由于很薄，當(dāng)梳子拉出后，它就會(huì)和玻璃分離，剛好將加樣孔的口封住了，如果用20ul的加樣器加樣的話，這層凝膠很容易將樣品堵在外面，只要將這層凝膠除去，就可以順利加樣了。如果用專門的微量進(jìn)樣器，不會(huì)存在這樣的問(wèn)題。（5） 薄膜原因可能是由于梳子和slide的厚度不是十分一致，而這可能是無(wú)法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子時(shí)候造成的堵塞現(xiàn)象，個(gè)人認(rèn)為，這樣的堵塞現(xiàn)象可以通過(guò)插入梳子時(shí)先用水（配置電泳緩沖液的水）濕潤(rùn)梳子的方法避免，這樣還有利于形成整齊的加樣孔。不管怎么做，一定要等膠完全聚合好了再拉出梳子。如果孔的形狀變化了，扭曲了，肯定會(huì)導(dǎo)致條帶不一致，結(jié)果不好。（6） wangjun2002274主任的：加樣的時(shí)候也是用專門的微量進(jìn)樣器，是寧波出的，50ul容量，每次都是用20ul的上樣量。以前等膠干后拔出梳子，馬上用水沖洗進(jìn)樣孔，就是用的那種塑料瓶擠壓沖洗，薄膜就沒(méi)有了，注意不要用力過(guò)猛，如果膠還沒(méi)有完全凝，很可能導(dǎo)致進(jìn)樣孔不整齊，那么跑出來(lái)的條帶就有窄有寬了。.配膠注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過(guò)濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4°C，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度<10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度>10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動(dòng)。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過(guò)降低張力清除殘留水滴。灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次**梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長(zhǎng)時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。丙烯酰胺和甲叉我是從北京華美買的德國(guó)biomol原裝貨，配出來(lái)的膠可以提在手里玩，彈性非常好，價(jià)格比sigma的便宜許多，1公斤好像是480多人民幣，夠?qū)嶒?yàn)室用好長(zhǎng)時(shí)間，現(xiàn)在我們實(shí)驗(yàn)室做雙向電泳都用biomol的膠，很好用。Marker我現(xiàn)在用fermantas的SM1811,2微升就很清晰了，蘭州的代理是上海生工。要強(qiáng)調(diào)的是垂直電泳緩沖液千萬(wàn)不能回收用，具體愿因你只需上網(wǎng)查查SDS的原理就知道了。轉(zhuǎn)移電泳緩沖液可以回收再用兩次。電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：^條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好.^條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全.拖尾：樣品溶解不好.紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒.條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜.條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過(guò)多.聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果不正常現(xiàn)象和對(duì)策：指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上或向下的現(xiàn)象.向上的"微笑"現(xiàn)象說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，所以導(dǎo)致凝膠中分子有不同的遷移率所致.這種情況在用較厚的凝膠以及垂直電泳中時(shí)常發(fā)生.向下的"皺眉"現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的,特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的"三明治"底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象."拖尾"現(xiàn)象是電泳中最常見(jiàn)的現(xiàn)象.這常常是由于樣品溶解不佳引起的，克服的辦法是在加樣前離心，選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液，加增溶輔助試劑.另一方法是降低凝膠濃度."紋理"現(xiàn)象常常是由于樣品中不溶顆粒引起的，克服辦法是增加溶解度和離心除去不溶性顆粒.蛋白帶偏斜常常是由于濾紙條或電極放置不平行所引起的，或由于加樣位置偏斜而引起.蛋白帶過(guò)寬，與鄰近蛋白泳道的蛋白帶相連，這是由于加樣量太多或加樣孔泄漏引起的.蛋白帶模糊不清和分辨不佳是由于多種原因引起的.雖然梯度凝膠可以提高分辨率，但與其他方法相比，常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳是分辨率較低的方法.為了提高分辨率，不要加過(guò)多的樣品，小體積樣品可給出窄帶.加樣后應(yīng)立即電泳，以防止擴(kuò)散.選擇合適的凝膠濃度,使組分得以充分的分離.通常靠近前沿的蛋白帶分辨率不佳，所以應(yīng)根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關(guān)系,灌制足夠長(zhǎng)度的凝膠，以使樣品不會(huì)走出前沿.樣品的蛋白水解作用也引起擴(kuò)散而使分辨率降低.水解作用通常發(fā)生在樣品準(zhǔn)備的時(shí)候，系統(tǒng)中的內(nèi)源性蛋白酶會(huì)水解樣品蛋白，如果在緩沖液中加蛋白酶抑制劑可以減少這種情況的發(fā)生.電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：^條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好.^條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全.拖尾：樣品溶解不好.紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒.條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜.條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過(guò)多.聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果不正常現(xiàn)象和對(duì)策：指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上或向下的現(xiàn)象.向上的"微笑”現(xiàn)象說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好,所以導(dǎo)致凝膠中分子有不同的遷移率所致.這種情況在用較厚的凝膠以及垂直電泳中時(shí)常發(fā)生.向下的”皺眉”現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的,特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的"三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象."拖尾"現(xiàn)象是電泳中最常見(jiàn)的現(xiàn)象.這常常是由于樣品溶解不佳引起的，克服的辦法是在加樣前離心，選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液，加增溶輔助試劑.另一方法是降低凝膠濃度."紋理"現(xiàn)象常常是由于樣品中不溶顆粒引起的，克服辦法是增加溶解度和離心除去不溶性顆粒.蛋白帶偏斜常常是由于濾紙條或電極放置不平行所引起的，或由于加樣位置偏斜而引起.蛋白帶過(guò)寬，與鄰近蛋白泳道的蛋白帶相連，這是由于加樣量太多或加樣孔泄漏引起的.蛋白帶模糊不清和分辨不佳是由于多種原因引起的.雖然梯度凝膠可以提高分辨率，但與其他方法相比，常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳是