雨生紅球藻培養(yǎng)條件及培養(yǎng)條件對蝦青素的影響

紅芽藻類是生活在淡水中的綠色植物。根據(jù)特殊情況，可以積累大量類毒素（可達干重2%5%）。80%以上的蝦青素及其酯類蝦青素被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。根據(jù)近年來的研究，蝦青素具有許多重要的生理和生物學功能，如抗旱性、腫瘤性和革蘭氏性。它在食品添加劑、保健品、佐劑和醫(yī)藥行業(yè)中具有廣闊的應用前景。雨生紅球藻的生活周期主要分為營養(yǎng)細胞和厚壁孢子.一般認為環(huán)境有利時,主要以綠色、能運動的藻體形式存在;環(huán)境不利時,形成厚壁孢子并大量累積蝦青素.因此雨生紅球藻的營養(yǎng)生長與蝦青素累積所需的條件是不同的.本文分別就雨生紅球藻培養(yǎng)過程中營養(yǎng)生長階段和蝦青素累積階段若干因素進行研究,希望為雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)和開發(fā)利用提供實驗基礎.1材料和方法1.1藻類與基本繁殖條件雨生紅球藻HB712,藻種由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供.所有培養(yǎng)均以BBM為基本培養(yǎng)基.BBM培養(yǎng)基組分見文獻.1.2顯光照培養(yǎng)箱CARY50BIO紫外-可見分光光度計;150C數(shù)顯光照培養(yǎng)箱(江蘇省金壇市榮華食品有限公司);YSJ-2高速離心機(廣州國華電器廠);LD-42低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);JD-3照度計(上海市嘉定學聯(lián)儀表廠).1.3實驗方法12細胞計數(shù)按照金傳蔭等的方法,用“浮游生物計數(shù)框”進行細胞計數(shù).2計算生長速率的比率根據(jù)普通微生物學通用公式計算.32蝦青素含量測定參照文獻的方法,進行色素的提取和測定.2結果與分析2.1雨生紅球藻葉綠素吸收峰的確定藻細胞對數(shù)生長培養(yǎng)物經(jīng)充分振蕩混勻后,置CARY紫外-可見分光光度計掃描可見光譜吸收曲線,僅在681nm處存在一明顯吸收峰,這是雨生紅球藻藻體內(nèi)葉綠素的吸收峰.二者在光密度0.1～1.1滿足線性關系:O.D681=2×10-6N+0.0327.其中N表示雨生紅球藻游動細胞密度(個/mL).最小方差R2=0.9891,相關系數(shù)顯著,因此可利用培養(yǎng)物在681nm波長處的OD值來測定細胞密度.2.2不同溫度對雨生紅球藻細胞生長的影響采用BBM培養(yǎng)基,在pH為8.0,光照強度為1000lx,24h連續(xù)光照條件下,試驗溫度設置為18、21、24、27、30℃,測定溫度對雨生紅球藻生長速率的影響.結果如圖1.細胞生長速率在24℃以下隨溫度的升高而增大,但超過24℃后生長速率隨溫度的上升而降低,24℃下生長速率達到0.251d-1.鏡檢結果表明,27℃和30℃組在培養(yǎng)5d后原來綠色游動細胞轉為不動細胞,細胞內(nèi)出現(xiàn)少量蝦青素累積.而24℃以下各組直至培養(yǎng)結束(第10天)才出現(xiàn)部分游動細胞轉化成不動細胞.因此,較低的溫度有利于雨生紅球藻保持較長的生長周期以及較高的生長速率.從試驗結果來看,24℃左右較適合雨生紅球藻細胞數(shù)目增長,細胞生長速率達到0.251d-1.2.3ph值對雨生紅球藻細胞生長的影響用NaOH調(diào)節(jié)BBM培養(yǎng)基的pH分別為6.0,7.0,8.0,9.0,10.0.培養(yǎng)物置于23℃下恒溫培養(yǎng),光照強度為1000lx.每日定時取樣測定藻體吸光度并添加少量NaOH維持恒定pH值.不同的pH值條件下雨生紅球藻細胞生長曲線如圖2所示.從圖2可知,在不同的pH值下,前4d藻的生長沒有明顯差距,從第5天開始一直到培養(yǎng)結束(第10天),差別開始增大.其中以pH=8.0為最適合雨生紅球藻生長的pH,在實驗設置的條件下,ρ細胞密度在培養(yǎng)的第10天達到4.18×105個·mL-1.并且在pH=10.0的情況下,雨生紅球藻只能維持6d的細胞增長,6d后細胞數(shù)目開始減少,鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞大多數(shù)轉為不動的孢子態(tài).2.4不同光照模式對雨生紅球藻生長的影響采用BBM培養(yǎng)基,23℃恒溫培養(yǎng),光照強度設置500、1000、1500、2000、2500lx.光照模式設置:24h連續(xù)光照和12∶12光暗光亮周期.結果如圖3所示.光照強度為500～1500lx,24h連續(xù)光照下,雨生紅球藻的生物量隨光照強度的增加而增加,細胞密度從500lx光照強度下的2.42×105個·mL-1增加至1500lx光照強度下的3.26×105個·mL-1.光照強度超過1500lx,生物量隨光照強度的增加反而降低,2500lx光照強度下細胞密度僅達到1.46×105個·mL-1.鏡檢發(fā)現(xiàn)在2000～2500lx高光強下,24h的連續(xù)光照導致大量藻在培養(yǎng)7d后從游動細胞向不動細胞轉化,故生物量增長低.而在12h∶12h光暗周期下,雨生紅球藻在500～2500lx范圍內(nèi),生物量均隨光照強度的增加而增加.從不同的光照模式比較,較低的光照強度(1000～1500lx)連續(xù)光照優(yōu)于較強的光照強度12h∶12h光暗周期.在研究了雨生紅球藻fachb-712株適宜生長溫度、光照強度、光照周期和pH條件,故采用24℃,1000lx連續(xù)24h光照,pH控制在8.0附近,培養(yǎng)周期為10d,雨生紅球藻fachb-712株平均生長速率達到0.252d-1,高于葉勇等報道的雨生紅球藻712株平均生長速率0.137d-1.2.5正交試驗結果適宜條件培養(yǎng)10d后的雨生紅球藻培養(yǎng)物經(jīng)離心,藻種團接種于不同NaNO3、FeSO4、乙酸鈉濃度的BBM培養(yǎng)基中.溫度控制在30±0.5℃,初始接種pH=8.0,光照強度提高至5000lx,連續(xù)光照.連續(xù)培養(yǎng)10d,隔日定時取樣測定培養(yǎng)物蝦青素含量.據(jù)文獻報道,高光強、高溫、營養(yǎng)鹽(氮、磷)缺乏、鹽(NaCl、NaAc等)脅迫和氧化壓力(活性氧、氧自由基和溶解氧)等許多環(huán)境條件都可以誘導雨生紅球藻細胞內(nèi)蝦青素的累積.實驗通過調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基中NaNO3,FeSO4和NaAc的濃度,設計L9(33)正交表進行試驗,正交試驗所用因素和水平如表1,設3個重復以減少誤差,期望證實營養(yǎng)鹽缺乏、鹽脅迫及氧化壓力對細胞的綜合影響.正交實驗結果采用方差分析,結果見表2,NaNO3濃度對雨生紅球藻蝦青素的累積影響顯著(FNaNO3>F0.05(2,4)),FeSO4和乙酸鈉濃度對蝦青素的累積并無顯著性影響.但從極差分析結果(未列出)表明,高的Fe2+和高濃度的乙酸鈉濃度均有利于雨生紅球藻的累積,這同文獻報道的Fe2+通過Fenton反應產(chǎn)生羥基自由基,羥基自由基作為一種活性氧,為誘導狀態(tài)下的細胞累積蝦青素提供一種氧化壓力,從而Fe2+的加入活化了類胡蘿卜素合成的酶系統(tǒng)的結論相吻合.對于高濃度的乙酸鈉濃度屬于高鹽脅迫導致的誘導蝦青素累積的環(huán)境因素之一.但是由于乙酸鈉屬于有機碳源,作為培養(yǎng)基容易引起細菌增殖,且對蝦青素累積含量的提高并沒有顯著性影響,故我們認為誘導培養(yǎng)基并不需要添加乙酸鈉.最優(yōu)方案組合為:A3B1C3,即FeSO4濃度0.02g/L,NaNO3濃度0g/L,乙酸鈉濃度4g/L的修正BBM培養(yǎng)基適合雨生紅球藻細胞內(nèi)蝦個素的累積,適宜溫度為30℃,接種pH=8.0,光照強度為5000lx,連續(xù)光照.經(jīng)過缺氮的BBM培養(yǎng)基,在30℃,24h連續(xù)光照,光照強度為5000lx的條件下進行3次重復驗證實驗,結果雨生紅球藻細胞內(nèi)累積的蝦青素平均含量達到6.72μg·mL-1執(zhí)著近正交試驗第4中出現(xiàn)的蝦個素最高含量(數(shù)據(jù)無顯著性差異).因此認為蝦青素誘導階段和細胞增殖階段在培養(yǎng)基方面的區(qū)別就在于誘導階段和細胞增殖階段在培養(yǎng)基方面的區(qū)別就在于誘導階段需要的是缺氮的BBM,只要在配制BBM培養(yǎng)基時不添加NaNO3即可,無須再改變其他成份.3雨生紅球藻蝦青素累積的培養(yǎng)1)試驗表明,24℃、1000～1500lx連續(xù)光照,pH控制在8.0左右的生長條件適合雨生紅球藻游動細胞增殖與生物量的增加,平均生長速率達到0.252d-1.缺氮培養(yǎng)基對于雨生紅球藻細胞累積蝦青素最為有利,FeSO4和乙酸鈉濃度對蝦青素的累積無顯著性影響.經(jīng)過缺氮的BBM培養(yǎng)基,在30℃,24h連續(xù)光照,光照強度為5000lx的條件下,雨生紅球藻細胞內(nèi)累積的蝦青素含量達6.72μg·mL-1.故采用缺少氮源的BBM培養(yǎng)基即可用于雨生紅球藻蝦青素的累積.2)由于雨生紅球藻生物量的累積和蝦青素其次級代謝產(chǎn)物蝦青素累積所需的培養(yǎng)條件是不同的.故在生產(chǎn)上應考慮采用兩步法,即首先在最適生長條件下培養(yǎng)雨生紅球藻的運動細胞,最大限度地獲取生物量,接著通過改變培養(yǎng)條件誘導蝦青素的大量累積.3)有報道指出營養(yǎng)缺陷不是限制細胞轉化的主要因素,還有重要的未明物質(zhì)發(fā)揮著調(diào)節(jié)雨生紅球藻細胞周期的作用.這種物質(zhì)由雨生紅球藻本身釋放到胞外,具有誘導細胞轉化或阻遏細胞分裂