大腸桿菌抗氧化應激反應的蛋白質(zhì)組學分析摘要在細胞代謝過程中，部分電子逃逸出氧化還原系統(tǒng)，以氧分子作為電子受體，產(chǎn)生具有毒害作用的高能量活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ROS)，包括超氧陰離子、單線態(tài)氧、過氧化氫、羥自由基和脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物。活性氧是一種廣譜殺菌劑,是宿主細胞抗菌作用的有效方式。但細菌在長期的進化過程中必然會發(fā)展出多種對策來抵抗宿主所產(chǎn)生的活性氧的殺菌作用。為檢測與此相關(guān)的蛋白質(zhì),本研究主要通過正常及氧化應激條件下對大腸桿菌kl2的培養(yǎng)，差速離心法提取膜蛋白進行SDS,挖取具有明顯差異的蛋白質(zhì)條帶，經(jīng)膠內(nèi)酶切處理，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)進行鑒定分析。結(jié)果鑒定到兩種具有明顯差異的蛋白，麥芽糖孔蛋白、外膜蛋白OmpA表達量明顯下降，這兩種蛋白主要與小分子物質(zhì)滲透進入細胞有關(guān)，因此可以推測細菌為了適應周圍環(huán)境的改變關(guān)閉膜上小分子通道，減少過氧化氫攝入細胞內(nèi)，進而減少過氧化氫的毒害作用。通過本研究，我們可以初步闡明大腸桿菌的氧化應激機制。關(guān)鍵詞：活性氧；氧化應激反應；膜蛋白；MALDI-TOFMS/MS；過氧化氫ABSTRACTDuringthemetabolisminthecell,oxygenmoleculesasanimportantelectronacceptor,Alsoaccompaniedbysomeelectronicescapefromtheredoxsystem,producesomehighenergyreactiveoxygenspecieswhichhaspoisoned,includingsuperoxideanion(O2-),singletoxygen,hydrogenperoxide,hydroxylradical,alsoincludestheintermediateproductsoflipidmetabolism.Reactiveoxygenspecies(ROS)isabroad-spectrumfungicide.Itisoneoftheeffectivewaytohostcellantimicrobial.However,bacteriainthelong-termevolutiondevelopmentofavarietyofstrategiestoresistthehostimmunebactericidalaction.Todetectwhichproteinsassociatedwiththissystem,inthisstudy,mainlythroughtrainingtwogroupofthepathogenicE.coli,theoneTreatmentbyhydrogenperoxide,theotheroneasthecontrolgroup,Brokencellsbyultrasound.Extractionthemembraneproteinsbydifferentialcentrifugation,makeaSDSelectrophoresiswiththeProtein,Diggingthesignificantdifferenceproteinband,aftergeldigestion,thenidentifiedbyMALDI-TOF-MS/MS.Wefoundtwoproteinswhichhavesignificantdifference,theyareMaltoporinandoutermembraneproteinA(OmpA).MaltoporinandOmpAareassociatetothesmallmoleculespenetrateintothecells.Therefore,wecanspeculatethattoadapttotheenvironmentBacteriaClosemembranechannelsofsmallmoleculestoreducetheintakeofintracellularhydrogenperoxide,therebyreducingthetoxicityofhydrogenperoxide.Throughthisexperiment,wecaninitiallyclarifytheoxidativestressmechanismofE.coli.Keywords:Reactiveoxygenspecies;Oxidativestress;hydrogenperoxide;Membraneprotein;MALDI-TOF-MS/MS目錄摘要ABSTRACTTOC\o"1-5"\h\z第1章細菌抗氧化應激反應的研究進展1蛋白質(zhì)組學分析在細菌抗氧化應激研究中的應用1金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)組學分析1幽門螺旋桿菌的蛋白質(zhì)組學分析1枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)組學分析2在其他菌株上的蛋白質(zhì)組學分析2蛋白質(zhì)組學分析的概括3第2章材料和方法5實驗流程圖52.2材料及主要實驗儀器62.3試劑72.4實驗過程102.4.1大腸桿菌擴大培養(yǎng)10氧化應激處理102.4.3細胞破碎112.4.4膜蛋白提取112.4.5制膠112.4.6樣品處理12SDS分析12MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定13第3章實驗結(jié)果14第4章討論18過氧化氫的濃度18質(zhì)譜結(jié)果分析18前景展望19參考文獻20致謝23#TEMED5吐AP30吐最后加AP,加完后立即混勻，灌膠。(為了加快凝膠，可以將AP和TEMED的量加大，一般為原來的2-3倍，電泳緩沖液視制膠環(huán)境溫度而定)50mMTrisBase30.3g甘氨酸144.1gSDS10g加800ml超純水充分溶解后，定容到1L,這是10x的緩沖液。使用時需用超純水稀釋10倍。樣品loadingbuffer(2X)100mMTris-HCl(pH6.8)4%(w/v)SDS0.2%(w/v)溴酚藍20%甘油(v/v)200mM巰基乙醇充分混勻，-20°C保存，使用前在沸水中加熱1min。考馬斯亮藍染色液考馬斯亮藍R-2501g甲醇450ml蒸餾水450ml冰醋酸脫色液100ml乙醇250ml冰醋酸超純水定容至1L。80ml2.4實驗過程2.4.1大腸桿菌擴大培養(yǎng)[25]配置液體LB培養(yǎng)基分裝到10支試管中，密封，每支試管約2ml；100ml固體LB培養(yǎng)基于250ml錐形瓶，將這些培養(yǎng)基和洗干凈的4個培養(yǎng)皿在121°C,1MPa條件下滅菌20min,于烘箱中烘干，在紫外線滅菌30min的超凈工作臺中倒平板，從-80C冰箱中取出大腸桿菌k12菌株，將4支裝有2ml左右LB液體培養(yǎng)基的試管放到超凈臺中，在酒精燈附近用20yL的槍頭蘸下，小心丟進試管中，放在37C恒溫搖床上培養(yǎng)過夜（約12h）。然后在超凈臺中，用滅菌后的接種環(huán)在固體培養(yǎng)基上劃線，放到37C恒溫箱中過夜。待培養(yǎng)基上長出明顯的菌斑時，在超凈臺中，用20yL槍頭挑取菌斑分別投入4支含有液體培養(yǎng)基的試管中，酒精燈燒一下管口，然后密封，在37C恒溫搖床上培養(yǎng)過夜（約12h）。2.4.2氧化應激處理在超凈臺中，將培養(yǎng)好的細菌分別倒入4瓶裝有500ml液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別標號1、2、3、4。將4個錐形瓶放在恒溫搖床上，37C，轉(zhuǎn)速250rpm培養(yǎng)，每隔半個小時，在超凈臺取1ml于分光光度計中，測量其OD600的值。經(jīng)過大約3小時，1號OD60o為0.5855,2號0。600為0.5654,3號0。600為0.5862,4號的0。600為0.6144。取4個500ml已滅菌的離心管，分別標號1、2、3、4。將錐形瓶中的菌液分別倒入對應的離心管中，每管約300ml,在電子天平上稱量，使每兩管之間的重量誤差在0.05g以內(nèi)，然后放到離心機中，4500rpm,4C離心10min，小心倒去上清液，將剩下的菌液倒入對應離心管，重復上述步驟。向每個離心管中分別加入30mlPBS緩沖液，用1ml槍輕輕吹打，使沉淀充分重懸，將重懸后的溶液用5ml的移液槍轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，分別標號1、2、3、4。然后放到離心機中，4500rpm,4C離心10min,離心完畢后，小心傾倒去上清液。將四瓶裝有500mlPBS緩沖液的錐形瓶標號1、2、3、4,從中取出30ml緩沖液加入到對應的離心管中，用5ml移液槍充分吹打混勻，然后轉(zhuǎn)移到對應編號的錐形瓶中。向1、2號錐形瓶中加入10mmol過氧化氫溶液，輕輕搖晃混勻，把混勻的錐形瓶放到恒溫搖床上，37C,200rpm孵育1小時。2.4.3細胞破碎將孵育好的大腸桿菌分別從四個錐形瓶取一部分（約300ml）到500ml離心管中，在天平上平衡后，放入離心機，5000rpm，4°C離心10min,然后小心傾去上清液，將錐形瓶中剩余液體倒入離心管中，重復上述步驟，得到沉淀。向每管中加入10ml膜蛋白提取液，用移液槍輕輕吹打，充分混勻。然后將液體轉(zhuǎn)移到新的離心管中，分別標號1、2、3、4。取一支管子插入裝滿冰塊的燒杯中，放到超聲破碎儀中進行超聲破碎，超聲時間3s,間隔5s,功率40%，超聲180次，直到溶液澄清透明。膜蛋白提取[26]細胞破碎完全后，通過電子天平配平四支離心管，使誤差盡可能小，放入高速冷凍離心機，12000rpm，4C，離心20min。離心完成后將上清液（胞漿蛋白及膜蛋白）轉(zhuǎn)移到特殊的離心管中,標號，通過天平配平，使相對應的兩組的質(zhì)量誤差不超過0.01go將轉(zhuǎn)子小心地放到超速離心機中，23500rpm，4C,離心1h。在離心管的底部有少部分的膜蛋白沉淀。倒去離心后的上清液，加入少量的膜蛋白提取液輕輕沖洗，然后將管子倒扣在吸水紙上析吸干，向離心管中加入200吐的膜蛋白緩沖液，用200吐的移液槍輕輕吹打，盡可能的少產(chǎn)生氣泡，約20min，蛋白沉淀充分重懸。分裝到1mlEppendorf管中，每管各裝100吐的膜蛋白混合液。對應標號，其中1、2編號的Eppendorf管中是過氧化氫處理后的膜蛋白，3、4編號的Eppendorf管中是對照的膜蛋白。將這些膜蛋白保存于-20C冰箱中待用。制膠清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后，用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗干凈后立在架子上晾干。灌膠：1、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）2、按前面方法配10%分離膠，加入AP后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用lml槍分次吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）3、當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。4、按前面方法配4％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5、用水沖洗一下濃縮膠，將其放入4°C冰箱保存。樣品處理從冷凍冰箱中取出樣品1號和3號，用100yL移液槍從1號管和3號管中各取40吐液體，放入新的EP管，標號1、3。1號中的樣品為過氧化氫處理過的大腸桿菌的膜蛋白，3號為對照組。向兩個EP管中加入等體積的loadingbuffer（2X），放在沸水中加熱10min。加熱完后，放到小型離心機中，12000rpm離心5min。SDS分析[24,25]將制好的膠從4C冰箱中取出，放入電泳槽，向內(nèi)槽加入稀釋后的電泳緩沖液，液面至少沒過內(nèi)側(cè)小玻璃板。外槽加入用過的電泳緩沖液，沒過金屬絲即可。向加樣孔中分梯度加入樣品，從左到右分別是10吐、8吐、5吐、2.5吐，處理過的樣品和對照樣品兩兩對應。最右邊加入Marker。蓋上蓋子，插上電源，剛開始電泳電壓為80V,待樣品跑過濃縮膠（約30min），進入分離膠后，把電壓改為120V繼續(xù)，直到溴酚藍剛剛跑出膠的底部，停止電泳。將跑完的膠小心取出，如果太干就用自來水濕潤，以防破裂。將膠放入洗干凈的培養(yǎng)皿中，加入考馬斯亮藍在轉(zhuǎn)速為70rpm的搖床上染色2h。加入脫色液放到轉(zhuǎn)速為70rpm的搖床上脫色，30min后換一次脫色液。然后繼續(xù)脫色4小時即可看到清晰條帶。如果要過夜脫色，可以向100ml超純水中加入1.46gNaCl作為脫色液。2.4.8MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定觀察SDS膠，用洗干凈的手術(shù)刀從上樣量濃度相近的兩組泳道上挖取3條差異最明顯的條帶，然后分別切成約lmmxlmmxlmm大小的膠粒，放入兩個EP管，分別標號1、2。每管加入50吐脫色液（50%乙腈，25mmol/L碳酸氫銨），室溫放置30min；吸去脫色液，重復以上步驟脫色至膠塊無色透明。抽真空離心干燥30min左右至白色顆粒狀，加入2yL（濃度為10ng/yL）溶于20mmoL/L碳酸氫銨的胰蛋白酶，4°C吸脹1h，吸去多余的酶液，將管子倒置，37°C空氣浴過夜。每個裝有膠粒的EP管中加入85%三氟乙酸，37C1h，將液體吸凈轉(zhuǎn)移至一干凈的離心管中，每個蛋白質(zhì)膠粒再加入8yL2.5%三氟乙酸/50%乙腈，30C1h,吸出液體與前一次的提取液合并，抽真空離心干燥。用2yL0.5%三氟乙酸充分溶解肽段立即進行MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定［26。第3章實驗結(jié)果由于不知道樣品濃度，第一次上樣量分別是20yL、15yL、10yL,——對應，發(fā)現(xiàn)對照組的10yL條帶比較清晰，而氧化應激處理后的樣品中蛋白含量比較濃，條帶不清晰，故第二次重新跑SDS電泳，調(diào)整上樣量，分梯度進行，其中對照組取10yL不變，而處理組則分梯度，分別上樣量為10yL、8yL、5yL、2.5yL,重新跑電泳，結(jié)果如下（圖3-1）：對照處理對照處理對照marker處理對照處理樣品類型10101081025102.5上樣量（“1）圖3-1可以明顯的看到，處理組與10yL對照組樣品中的蛋白含量接近的是5yL與8yL這兩組，因此重新調(diào)整上樣量，對照組樣品上樣量全取9yL,氧化應激處理過的樣品，分別取6yL、5yL、4yL、3yL、2yL。電泳結(jié)果如下（圖3-2）：

圖3-2從上述膠中可以明顯發(fā)現(xiàn)，處理組5yL樣品中所含的蛋白與對照組9yL樣品所含蛋白量差不多，故這兩條帶上挖取差異最明顯的2個條帶，編號1、2，如圖3-3所示，切成約1mmxlmmxlmm大小的膠粒，放入裝有超純水的EP管中。對關(guān)處理每管加入50yL脫色液室溫放置30min；吸去脫色液，重復以上步驟脫色至膠塊無色透明。抽真空離心干燥30min左右至白色顆粒狀，加入2yL溶于碳酸氫銨的胰蛋白酶，4°C吸脹1h,吸去多余的酶液，將管子倒置，37°C空氣浴過夜。對關(guān)處理每個裝有膠粒的EP管中加入85%三氟乙酸，37C1h，將液體吸凈轉(zhuǎn)移至一干凈的離心管中，每個蛋白質(zhì)膠粒再加圖3-3入8yL2.5%三氟乙酸/50%乙腈，30C1h,吸出液體與前一次的提取液合并，抽真空離心干燥。用2yL0.5％三氟乙酸充分溶解肽段立即進行

MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定，得到如下兩個圖譜：圖3-4為1號條帶圖譜，圖3-5為2號條帶圖譜。4013.03370.20魚O89L.龍polrj9akHOO98Lpgp9ln6ZL998P36,_luJ—907777A\60cngo8c.Mass(m/z)圖睜3and1)C900.9Z8L396C08L離茗t9廠5啟.69lr?一zgfopggSL「董gX6ZIOOI9M86s.EmE9」968CNggCM°—律9P0C6I4013.03370.20魚O89L.龍polrj9akHOO98Lpgp9ln6ZL998P36,_luJ—907777A\60cngo8c.Mass(m/z)圖睜3and1)C900.9Z8L396C08L離茗t9廠5啟.69lr?一zgfopggSL「董gX6ZIOOI9M86s.EmE9」968CNggCM°—律9P0C6I@瞿呂=宇建這9L.\0z\60tn.6969082L10090C909G9924E二2727.4O)、8e-O90固」ifeK.g98=9900888R￡d2084.6L6EE9Myxabze舊1062廠0ZS9mecL668蛍一gszggLAlwusu一津799.0Mass(m/z)圖3-5(Band2)通過查閱數(shù)據(jù)庫，比對鑒定得到兩種蛋白分別是麥芽糖孔蛋白（Maltoporinprecursor)、外膜蛋白0mpA(0utermembraneproteinAprecursor)，如下表3-1。表3-1質(zhì)譜鑒定結(jié)果BandAccessionNo.ProteinNameMWPep.CountProteinScoreProteinScoreC.I.%1gil125964lsplP02943.1ILAMBECOLMaltoporinprecursor(Maltose-inducibleporin)(Lambdareceptorprotein)49880.661911002gi|71159605|sp|P0A910.1QMPAECOLOutermembraneproteinAprecursor(OutermembraneproteinII*)37177.78426100第4章討論4.1過氧化氫的濃度由于h2o2具有殺菌作用，掌握好h2o2加入的濃度和反應時間是一個難點。所以第一次培養(yǎng)大腸桿菌時，加入孵育的濃度為0.8mmol/L、1mmol/L的過氧化氫，與對照組一起孵育1小時，然后再提取膜蛋白，做一個SDS電泳，條帶差異較小,調(diào)整過氧化氫濃度，重新培養(yǎng)大腸桿菌，這一次分別加入8mmol/L、20mmol/L的過氧化氫孵育，提取膜蛋白，跑SDS電泳，發(fā)現(xiàn)20mmol/L處理的樣品膜蛋白的條帶與8mmol/L處理和對照組的具有明顯的差別，而8mmol/L處理和對照組樣品的條帶基本一樣，由于這次樣品不多，第三次培養(yǎng)細菌，就分兩組，一組20mmol/L過氧化氫處理，另一組不處理做對照，孵育完后提取膜蛋白，保存樣品。4.2質(zhì)譜結(jié)果分析蛋白質(zhì)功能分析：1號條帶為麥芽糖孔蛋白，它參與麥芽糖和麥芽糊精的過膜運輸，具有攝取麥芽糖和麥芽糊精的功能。同時它也能做幾個噬菌體（包括lambda）的受體，缺乏膜孔蛋白，可抵抗某些噬菌體及蘭剛菌素的侵害，對細菌而言，具有進化意義［27］。2號條帶為外膜蛋白OmpA，該蛋白能通過產(chǎn)生大腸桿菌素K和大腸桿菌素L來保持共軛多聚體的穩(wěn)定。它可以當做一個T型噬菌體的受體，也可以作為低滲透（允許小分子滲透過膜）的孔蛋白［28-30］。由于經(jīng)過氧化氫孵育的樣品中麥芽糖孔蛋白和外膜蛋白OmpA的表達量明顯下降了，而這兩種蛋白都屬于通道蛋白。這說明大腸桿菌在有過氧化氫存在的環(huán)境中，為了適應新的環(huán)境，減少過氧化氫的毒害作用，菌體內(nèi)部的麥芽糖孔蛋白和外膜蛋白OmpA表達量下降，關(guān)閉了膜上的小分子通道，從而減少了過氧化氫進入菌體內(nèi)部，降低了過氧化氫對菌體的影響。通過這個實驗，我們初步闡明了細菌抗氧化應激應答的機制。前景展望通過上述實驗結(jié)果可以知道，細菌抵抗宿主的產(chǎn)生的活性氧的殺菌作用主要是依靠減少膜孔蛋白的編碼，關(guān)閉膜上小分子通道，從而降低了菌體內(nèi)的活性氧濃度，減少了活性氧對細胞的毒害作用，使細菌適應具有活性氧的環(huán)境，通過本實驗，初步闡明了大腸桿菌抗氧化應激的原理，同時為進一步的實驗提供了研究方向。參考文獻DanchenkoSC,HartM,BegerR.COmpArativeproteomicsofStaphylococcusaureusandtheresponsetoreactiveoxygenspecies[J]．FASEBJ,2006,20:LB66．WeberH，EngelmannS,BecherD,eta1.Oxidativestresstriggersthioloxidationintheglyceraldehydes-3-phosphatedehydro-genaseofstaphylococcusaureus[J]．MolMicrobiol,2004，52(1):133-140．ThroupJP，ZappacostaF，LunsfordRD，etal．ThesrhSRgenepairfromStaphy1ococcusaureus：genomicandproteomicapproachestotheidentificationandcharacterizationofgenefunction[J]．Biochemistry,2001,40(34):10392-10401．[4]游運輝.胃癌及慢性胃炎幽門螺桿菌的蛋白質(zhì)組學研究[J].中南大學學報(醫(yī)學版),2008,33(5):384-389MostertzJ，ScharfC,HeckerM,etal.TranscriptomeandproteomeanalysisofBacillussubtilisgeneexpressioninresponsetosuperoxideandperoxidestress[J].Microbiology,2004,150(pt2)：497TopanurakS，SinchaikulS，PhutrakulS，etal.ProteomicsviewedonstressresponseofthermophilicbacteriumBacillusstearothermophilusTLS33[J].Proteomics,2005,5(14):3722SvensaterG，SjogreenB，HamiltonIR．MultiplestressresponsesinStreptococcusmutansandtheinductionofgeneralandstress-specificproteins[J]．Microbiology,2000,146(Pt1):107OkanoS,ShibataY,ShirozaT,etal.Proteomics-basedanalysisofacounter-oxidativestresssysteminPorphyromonasgingivalis[J].Proteomics.2006,6(1):251[9]胡麗萍,沈巖．雙向凝膠電泳技術(shù)、蛋白質(zhì)組與基礎和臨床醫(yī)學[J].國外醫(yī)學分子生物學分冊,2001,23(2):118-121．[10]Lopez-CampistrousA，SemchukP，BurkeL，eta1．Localization，aB．uotation,andcOmpArisonoftheeseheriehiacolik12proteomeundertwostatesofgrowth．MdCellProteomies,2005,4：1205-1209．[11]ZengR，RuanHQ,JiangXS,eta1.ProteomieanalysisofSAPSassociatedcomnavimsusingtwo-dimensionalliquidehromatographymassspeetrometryandorle-dimensionalsodiumdodeeylsulfate-polyacrylamidegelelec?tmphoresisfollowedbymassspeetmemtrieanalysis.JProteomeRes,2004,3:549-555．[12]陳陽,徐維明?蛋白質(zhì)組學技術(shù)在幽門螺桿菌研究中的應用[J].WorldChinJDigestol,2005January,15,13(2):243-245．張愛玲，王興龍，等?蛋白質(zhì)組學技術(shù)及其在病原微生物研究中的應用J].中國預防獸醫(yī)學報,2008,30(5):408-410fieldss.Proteomicsingenomeland(J].Science，2001，291:1221-1224O'FarrellP.HHighresolutiontwo-dimensionaleletrophoresisofproteins[J].JBioChem，1975，250:4007-4021．KathrynSLilley，DavidBFriedman.DifferencegelelectrophoresisDIGE[J]．Proteomics，2006，3：347-353．TongeR，ShawJ，MiddletonB，etal．Validationanddiferentialgeloffluorescenceelectropho-resistechnology[J