第五章細胞破碎、蛋白質復性和固液分離廣州大學生命科學學院柯德森第五章細胞破碎、蛋白質復性和固液分離廣州大學生命科學學院1產物提純過程的不同決定于：對象材料、目標產物特性及對其純度的要求；包括兩個基本階段：初級分離階段、純化精制階段。產物提純過程的不同決定于：對象材料、目標產物特性及對其純度的2細胞破碎固液分離初級分離(粗)純化精制下游技術基本過程細胞破碎固液分離初級分離(粗)純化精制下游技術基本過程3初級分離：分離細胞和培養液，破碎細胞釋放產物，溶解包含體（包涵體），復原蛋白質，濃縮產物，去除大部分雜質等過程。主要決定產物的得率。純化精制：在初級分離的基礎上，用各種高選擇性手段，主要是各種層析技術，將目標產物和干擾雜質盡可能地分開，使產物的純度達到有關要求。主要決定產物的純度。初級分離：分離細胞和培養液，破碎細胞釋放產物，溶解包含體（包4總原則：控制時間、溫度、pH值，減少與空氣接觸的機會，設計好各組分的分離順序總原則：控制時間、溫度、pH值，減少與空氣接觸的機會，設計好5第二節細胞破碎目的：釋放細胞內含物。分類：按照是否存在外加作用力分為機械法和非機械法。問題：破碎率是否越高越好？高壓勻漿比珠磨法破碎細胞的效果好？第二節細胞破碎目的：釋放細胞內含物。問題：6破碎方式機械法非機械法固體剪切作用液體剪切作用干燥處理溶胞作用珠磨法高壓勻漿壓榨超聲破碎酶溶法化學法物理法細胞破碎方法分類圖破碎方式機械法非機械法固體剪切作用液體剪切作用干燥處理溶胞作71、高壓勻漿法組成：高壓泵和勻漿閥；作用機理：高壓泵將電機的旋轉運動轉變成勻漿閥柱桿的直線運動，從高壓室（幾十兆帕）壓出細胞懸浮液，經過碰撞環的撞擊后改變方向從出口管噴出，使細胞經歷較高的流速下的剪切碰撞發生較大的變形，從而達到破碎細胞的目的。1、高壓勻漿法組成：高壓泵和勻漿閥；8意大利Niro-Soavi實驗室級高壓均質機意大利Niro-Soavi實驗室級高壓均質機9高壓勻漿閥結構示意圖進液口出液口閥座碰撞環閥桿高壓勻漿閥結構示意圖進液口出液口閥座碰撞環閥桿10高壓勻漿法動力學方程破碎效率與勻漿閥結構、操作壓力和破碎次數有關：Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR：單位生物量釋放出的產物量（mg/G)Rm是R的最大值；K：破碎速率常數；N：破碎次數；P：操作壓力；a:與微生物性質有關的指數系數。高壓勻漿法動力學方程破碎效率與勻漿閥結構、操作壓力和破碎次數11溫控和能耗破碎率-----操作壓力------溫度控制-----能耗溫度對活性物質的失活作用；能耗與操作壓力有關：3.5KW/100MPa能耗也用于溫控：23.8C/100MPa溫控和能耗破碎率-----操作壓力------溫度控制---12存在問題堵塞（不適合團塊狀或絲狀真菌），質地堅硬如包含體易損傷勻漿閥也不適合溫度高易失活，能耗大。存在問題堵塞（不適合團塊狀或絲狀真菌），質地堅硬如包含體易損132、高速珠磨法原理：細胞和極細的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與細胞之間互相剪切，碰撞，促使細胞壁破裂，釋放內含物。2、高速珠磨法原理：細胞和極細的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合14幾種常見珠磨器幾種常見珠磨器15常見珠磨器舉例（廣東正本）常見珠磨器舉例（廣東正本）16動力學方程間歇操作:Ln(Rm/(Rm-R))=Ln(D)=KtD=(1+K1

/J)J連續操作Ln(Rm/(Rm-R))=KV/f=K`動力學方程間歇操作:17溫控和能耗采用夾套冷卻的方式實現溫控,效果較好;能耗與細胞破碎率成正比;問題：破碎率是否越高越好？高壓勻漿比珠磨法破碎細胞的效果好？溫控和能耗采用夾套冷卻的方式實現溫控,效果較好;問題：183、超聲破碎機理：聲頻高于15~20kHz的超聲波在高強度聲能輸入時可以進行細胞破碎，破碎機理尚未清楚，可能與空化現象引起的沖擊波和剪切力有關。破碎效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及菌種類型等因素有關。優點：操作簡便液量損失少存在問題：使敏感物質變性失活，噪聲大，大容量時效率低，應用潛力有限。3、超聲破碎機理：聲頻高于15~20kHz的超聲波在高強度聲19空化現象：在強聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現象?？栈F象：在強聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現象。20超聲波破碎儀超聲波破碎儀21大功率

超聲波破碎儀大功率

超聲波破碎儀224、化學滲透法作用機理：某些有機溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫滲透法。問題：EDTA、甲苯、TritonX-100、鹽酸胍和脲的作用機理？4、化學滲透法作用機理：某些有機溶劑，抗生素，表面活性劑，金23優點（相對機械破碎）：對產物釋出有一定的選擇性；細胞保持完整，碎片少，利于進一步提取；核酸釋放量少，黏度低，便于進一步分離。缺陷：時間長，效率低；化學試劑有毒；通用性差優點（相對機械破碎）：245、酶溶法機理：就是利用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、B-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、B-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽鏈內切酶（endopeptidase)、殼多糖酶(chitinase)、細胞壁溶解酶（幾種酶的復合物）等5、酶溶法機理：就是利用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解的方法25優點：一定的選擇性；細胞外形完整，核酸釋放少，有利于進一步分離過程缺點：（只能用于實驗室）產物抑制造成效率低下；溶酶價格高；通用性差，不易確定最佳條件；優點：266、微波加熱法機理：微波加熱導致細胞內極性物質，尤其是水分子吸收微波能，產生大量熱量，使胞內溫度迅速上升，液態水汽化產生的壓力將細胞膜和細胞壁沖裂，形成微小孔洞，進一步加熱可導致細胞內部和細胞壁水分減少，細胞收縮，表面出現裂紋。6、微波加熱法機理：微波加熱導致細胞內極性物質，尤其是水分子27優點：微波穿透性強，選擇性高、加熱效率高。缺陷：一般只適合對熱穩定物質的分離；被處理的物料要具有良好的吸水性；不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物優點：微波穿透性強，選擇性高、加熱效率高。28第三節蛋白質復性包含體（包涵體，inclusionbodies):存在于基因工程細胞中，主要由蛋白質構成，其中大部分是克隆表達的產物，這些產物在一級結構上是正確的，但在立體結構上卻是錯誤的，因此沒有生物學活性。難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。第三節蛋白質復性包含體（包涵體，inclusionbod29包含體形成原因：（比較復雜，目前尚不完全清楚。）缺少某些協助因子（分子伴侶？？）或者由于周圍物理環境（溫度等）不適，使其難以連續進行次級鍵的形成，中間產物相互凝集而積累形成包含體。問題：是否應該設法減少包含體的形成？如何減少？包含體形成原因：（比較復雜，目前尚不完全清楚。）30減少包涵體形成的策略1、

降低重組菌的生長溫度，降低培養溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。2、

添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑，培養E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質的蛋白質聚集反應，在最適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。3、

供給豐富的培養基，創造最佳培養條件，如供氧、pH等。減少包涵體形成的策略31蛋白質的復性：包含體蛋白質溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側鏈完全暴露，但一級結構和共價鍵不被破壞，當除去變性劑后，一部分蛋白質可以自動折疊成具有活性的正確構型，這一折疊過程稱為蛋白質復性。蛋白質的復性：包含體蛋白質溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態，所32包含體的分離及溶解

分離包含體：第一步是對培養收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理，然后5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離洗滌：包涵體沉淀需用去污劑（TritonX-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解包含體的分離及溶解分離包含體：第一步是對培養收集的細胞進行33溶解：包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強；去污劑，如SDS，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業中；酸，如70%甲酸，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數蛋白質。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標蛋白有時也應使用還原劑，因為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與還原狀態的巰基發生氧化反應[10]。要求了解：用于溶解包含體的主要（1）增溶劑（變性劑、去污劑、酸）及其增溶機理；（2）主要還原劑，為什么加入還原劑；（3）主要金屬螯合劑，為什么要加入。溶解：包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、634蛋白質的折疊機理

包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態，在變性劑去除或濃度降低時，就會自發的從變性的熱不穩狀態向熱力學穩定狀態轉變，形成具有生物活性的天然結構。蛋白質的折疊機制，目前有多種不同的假設，但很多學者認為有一個“熔球態”的中間狀態，在“熔球態”中，蛋白質的二級結構已經基本形成，其空間結構也初具規模，再做一些局部調整就可形成正確的立體結構，蛋白質的具體步驟可用下式描述：伸展態→中間體→后期中間體→天然態體→聚集體蛋白質的折疊機理包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態，35提高重組蛋白質折疊復性的方法

錯誤發生的原因：在去除變性劑的同時，重組蛋白質在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復性的效率實際上取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭。錯誤發生的機制：提高重組蛋白質折疊復性的方法錯誤發生的原因：在去除變性劑的36在折疊反應中，從伸展態到中間體的速度是非?？斓模恍枰獛缀撩?，但從中間體轉變為天然態的過程比較緩慢，是一個限速過程。聚集過程與復性過程相互競爭，故而應盡量避免聚集體的產生。錯誤發生的機制①一般認為，蛋白質在復性過程中涉及兩種疏水作用，一是分子內的疏水相互作用，可促進蛋白質正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復性過程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導致蛋白質聚集。②蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環境的影響，如溫度、pH值、離子強度、復性時間等因素的影響。在折疊反應中，從伸展態到中間體的速度是非?？斓?，只需要幾毫秒37不同條件下具體復性方式1、透析、稀釋和超濾復性法：這三種方法是最傳統也是應用最普遍的蛋白質折疊復性方法，原理都是使變性劑濃度降低到蛋白質能恢復折疊的濃度。缺點：復性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。稀釋法大大增加溶液體積，不利于后續的分離純化；透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業放大不同條件下具體復性方式1、透析、稀釋和超濾復性法：這三種方法38問題：包含體蛋白質含有二個以上二硫鍵應該如何處理？為什么要在復性完成后再加入氧化劑？問題：包含體蛋白質含有二個以上二硫鍵應該如何處理？為什么要392、高蛋白濃度下的復性方法：（一個成功的復性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復性率。）①一個方法是把變性蛋白緩慢連續或不連續地加入到復性液中。在兩次蛋白加入之間，應有足夠的時間間隔使蛋白質折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由于完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。②第二種方法是用溫度跳躍策略：變性蛋白在低溫下復性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來促進后期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。③第三種方法是復性在中等的變性劑濃度下進行，變性劑濃度應高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發正確復性。2、高蛋白濃度下的復性方法：（一個成功的復性過程在于能夠在高403、

添加促進劑的復性方法：包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促進作用可以分為：穩定正確折疊蛋白質的天然結構、改變錯誤折疊蛋白質的穩定性、增加折疊復性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質的溶解性。3、

添加促進劑的復性方法：包涵體蛋白質折疊復性促進劑41通常使用的促進劑有：a、共溶劑：如PEG6000~20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復合物，可以阻止蛋白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質結合，很難去除；c、氧化-還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產率；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩定蛋白的活性狀態、降低非正確折疊的穩定性、增加折疊中間體的穩定性、增加解折疊狀態的穩定性。e、0.4~0.6ML-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質結構以及不正確連接的二硫鍵變得不穩定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質的折疊效率。通常使用的促進劑有：42通常使用的促進劑有：f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結合和穩定另外一種蛋白質的不穩定構象，并能通過有控制的結合和釋放，促進新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸的一類蛋白質。折疊酶有二硫鍵異構酶、脯氨酸異構酶等。分子伴侶和折疊酶都能在體外調節蛋白質的正確折疊，提高蛋白質的合成效率。但這類蛋白在折疊復性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。g、人工伴侶：為模仿分子伴侶而發展的一種方法：首先，變性蛋白被復性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復合體，復合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環糊精從復合體中去除去污劑，使得蛋白質正確折疊。h、單克隆抗體：待折疊復性的蛋白質的抗體可有效協助復性，但只限于此蛋白才能獲得明顯的助折疊作用。I其它：多聚離子化合物如肝素可以促進蛋白質的復性，具有穩定天然蛋白質的作用；甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機會，減少錯配以提高復性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團間的斥力，有利于蛋白質的折疊；輔助因子、短鏈醇、高滲物等能有效的降低聚集體的形成，對蛋白有穩定的作用。通常使用的促進劑有：434、

液相色譜（LC）復性法：疏水相互作用色譜（HIC）、離子交換色譜（IEC）、凝膠排阻色譜（SEC）、親和色譜（AFC）已成功的對變性蛋白進行了復性。4種色譜法，SEC的分離效果是LC中最差的，鹽酸胍會在IEC柱上保留，與蛋白一起洗脫下來，AFC使用范圍窄、所需時間長、價格昂貴，HIC是其中較為理想的。變性蛋白在HIC上的復性機理為：當蛋白質、變性劑和雜蛋白進入HIC系統后，由于變性劑在柱子上的作用力較弱，變性蛋白質的作用力較強，變性劑首先同變性的蛋白質分離，隨流動相一起流出色譜柱，又因HIC固定相能提供較常法高出十至數百倍的能量*，在變性蛋白質被HIC固定相吸附的同時瞬時除去以水合狀態附著在蛋白質表面和與固定相表面接觸區域的小分子*，而蛋白質的特定的疏水性氨基酸殘基與HIC固定相表面作用以形成區域立體結構，接著形成折疊中間體，隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質不斷地在固定相表面上進行吸附-解吸附-再吸附，并在此過程中逐漸被復性，形成與天然蛋白質構象相同的蛋白質，并流出色譜柱。HIC固定相是從高鹽溶液中吸附變性蛋白質，且與變性劑瞬時分離，不僅大大降低了蛋白質間的聚集作用，還因固定相在分子水平上為變性蛋白提供里很高的能量，使水化的變性蛋白質瞬時失水，并形成局部結構以利于蛋白質從疏水核開始折疊。HIC在蛋白質復性的同時還能與其它雜蛋白進行很好的分離，且HIC柱便宜、快速，故有很好的發展潛力。4、

液相色譜（LC）復性法：疏水相互作用色譜（HIC44與傳統的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優點是：在進樣后可很快的除去變性劑；色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質分子在脫離變性劑環境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產生，提高蛋白質復性的質量和活性回收率；在蛋白質復性的同時，可使目標蛋白質與雜蛋白分離達到純化的目的，使復性和純化同時進行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。與傳統的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優點是：455、反膠束復性法：由于蛋白質在反膠束內水相中可以保持其構象和活性，運用相轉移技術可以將蛋白質分子包于反膠束內，由于這樣可使蛋白質相互分離，減少了蛋白質折疊過程中的聚集作用，通過逐漸降低變性劑的濃度和加入氧化-還原劑，可使變性蛋白質復性，但表面活性劑對蛋白質具有變性作用。5、反膠束復性法：由于蛋白質在反膠束內水相中可以保持其構象和46第四節固液分離分離細胞、細胞碎片、包含體、沉淀物等的手段，不僅應用于初級階段，而且也應用于精制階段。第四節固液分離分離細胞、細胞碎片、包含體、沉淀物等的手段，47一、離心沉降根據固體和液體之間的密度差,利用離心機提供的離心力實現固液分離的手段.是實現固液分離的主要手段;優點：技術易掌握；結果重復性好沉降的難易取決于固體物質和液體的密度差,同時還取決于固體和液體的其他性質以及離心機的離心能力.(可以顆粒沉降速度表示)一、離心沉降根據固體和液體之間的密度差,利用離心機提供的離心48斯托克斯公式(Stokes):Uc=d2(ρs-ρL)rω2/18μUc顆粒沉降速度;d顆粒直徑(假定為球形)ρs是固體密度ρL是液體密度r離心半徑;ω角速度;(rω2:離心力)μ粘度斯托克斯公式(Stokes):49(rω2:離心力):是固液分離最重要的影響因素;分離因數:a=(rω2:離心力)/ga是衡量離心力的大小主要指標,應該主要是增大角速度而不是直徑;提高離心效果可通過增加轉速和延長時間來取得；(rω2:離心力):是固液分離最重要的影響因素;50轉筒常規工業用離心機

（--張家港華大離心機公司）SSC型離心機為三足式上部人工卸料沉降離心機，該系列離心機裝鼓壁上無孔，屬沉降型轉鼓，操作維修方便。主要使用于固相顆粒細小，懸浮液粘性較大，過濾介質再生困難，且含量較少的懸浮液的固液分離。。

轉筒常規工業用離心機

（--張家港華大離心機公司）SSC型離51管式工業用離心機

（--張家港華大離心機公司）懸浮液從進料管進入轉鼓，固相顆粒在離心力場作用下受到離心力的加速沉降至轉鼓內壁，沉降的顆粒在螺旋輸送器葉片的推動下，從（直筒段）沉降區通過（錐段）干燥區至固相出口排出；經澄清的液相從溢流孔溢出。從而實現固、液相自動、連續的分離?？蓱糜诿撍饪s、分級澄清等不同場合。

管式工業用離心機

（--張家港華大離心機公司）懸浮液從進料管52刮刀卸料工業用離心機

（--張家港華大離心機公司）主電機帶動套裝的內外轉鼓全速旋轉，物料由進料管引入轉鼓，在離心力作用下，液相物穿過濾布和內轉鼓壁濾孔排出內轉鼓，匯集到內外轉鼓間的間隙內，穿過到虹吸室的通孔進入虹吸室，再由虹吸裝置抽走排出機外。固相物截留在內轉鼓形成環形濾餅層。進料達到預定容積后停止進料，進一步分離，此時可進行洗滌。洗滌、分離結束，刮刀自動旋轉，將固相物刮下經輸料螺旋排出機外，然后自動洗網，開始下一個循環。刮刀卸料工業用離心機

（--張家港華大離心機公司）主電機帶動53二、微孔膜過濾根據流體各組分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，過濾分離微米級的細胞、細胞碎片和生物大分子的過程，叫微孔膜過濾。目前主要有三種膜過濾方式：微孔過濾：超濾：反滲透：切割分子量?微孔膜超濾膜反滲透膜二、微孔膜過濾根據流體各組分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜54優點：容易做到封閉式操作，不受環境污染設備投資少，操作安全；加工量可大可小，十分方便；有利于分離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程。缺點：技術難以掌握，影響因素多；穩定性和重復性不好；膜堵塞問題是最難以解決的問題優點：55微濾技術要點：選擇合適的膜：①不與蛋白質、脂類等發生吸附；②選擇合適的孔徑；③無機陶瓷膜的選擇及其優點選擇合適的操作條件：達西公式：V=ΔP/[μ(Rc+Rm)]問題：從達西公式分析操作條件的選擇，維持Rc(濾餅阻力)方式？微濾技術要點：選擇合適的膜：①不與蛋白質、脂類等發生吸附；②56無機陶瓷膜的優缺點優點：（機械強度大、惰性更大）孔徑均勻，過濾效果好；耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機溶劑；堅固耐用，使用壽命長；可以加壓反向沖洗缺點：造價高；過濾面積??；表現對蛋白質一定的吸附；無機陶瓷膜的優缺點優點：（機械強度大、惰性更大）57各種微孔膜柱及設備各種微孔膜柱及設備58各種微孔膜柱及設備各種微孔膜柱及設備59操作方式切向流過濾（錯流過濾、交叉流過濾、十字過濾）：就是一種維持恒壓下高過濾速度的技術，其原理就是：使懸浮液在過濾介質表面作切向流動，利用液體的剪切作用將介質表面的固體移走，當移走固體與固體沉積速率相同時，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。（實際是維持了Ｒc).目前幾乎所有的膜固液分離都采用切向流方式操作方式切向流過濾（錯流過濾、交叉流過濾、十字過濾）：60細胞破碎蛋白質復性和固液分離-生物探索課件61細胞破碎蛋白質復性和固液分離-生物探索課件62細胞破碎蛋白質復性和固液分離-生物探索課件63切向流過濾的缺點產生的剪切力使蛋白質產物失活，流速越快，失活越嚴重；能耗比較高；不能避免膜的污染和堵塞，當膜的阻力增大時，無法防止過濾速度的下降；切向流過濾的缺點產生的剪切力使蛋白質產物失活，流速越快，失活64２、脈沖反洗切向流過濾原理：在切向流過濾中間歇地在膜的背面加一反壓，迫使部分濾液反透過膜以沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物，使過濾速度保持在比較高的水平。２、脈沖反洗切向流過濾原理：在切向流過濾中間歇地在膜的背面加65細胞破碎蛋白質復性和固液分離-生物探索課件66３、調整生化懸浮液的性質調整pH值和離子強度；加入絮凝劑；加入過濾助劑（硅藻土系列）３、調整生化懸浮液的性質調整pH值和