黃芩苷體外抗馬立克氏病病毒作用的研究

中醫藥是確保動物健康飼養并取代抗生素的重要手段之一。近年來,有諸多科研工作者對黃芩苷抗病毒抗腫瘤作用進行了較詳細的研究。結果證實,黃芩苷在一定濃度下有抗病毒作用,主要是通過抑制病毒在感染的A459細胞內生物合成而發揮抗病毒作用1材料和方法1.1材料表面1.1.1細胞SPF雞胚,由山東育鳳農業科技有限公司提供。取9~11日胚齡雞胚按常規方法制成雞胚成纖維細胞(CEF)備用。1.1.2素的提取方法黃芩苷,黃芩購于聊城利民中藥有限公司,通過試驗得最佳提取因素采用水煎煮法獲得。稱取黃芩苷1g溶于50mL細胞維持液中,調pH至7.0~8.0,使其完全溶解,成為20mg/mL母液,試驗時用維持液稀釋至對CEF的安全濃度。1.1.3蘇辣博士大學博士致四十四博士捐贈馬立克氏病病毒(MDV)Ⅰ型致弱病毒CV2988/Rispens由山東農業大學動物醫學院蘇帥博士饋贈。將凍存的病毒株復蘇后接種于CEF,于2~5d出現病變,待病變達100%時收獲病毒,1500r/min離心5min,棄上清,加細胞凍存液分裝后保存備用。1.1.4素和鏈霉素胎牛血清,購自浙江天杭生物科技有限公司;青霉素和鏈霉素,購自新鄉市華畜商貿有限公司;DMEM培養粉、胰蛋白酶、細胞凍存液、MTT溶液、二甲基亞砜(DMSO),購自Gibco公司。1.1.5儀器、設備和試藥DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司);IX73生物顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司);GI54TR自動蒸汽滅菌鍋(致微(廈門)儀器有限公司);TGL-16B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);LE204E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);IL-161CTCO2培養箱(施都凱儀器設備(上海)有限公司);DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司);SW-CJ-2F潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司);SC-350立式冷藏柜(海爾公司);DW-25W198醫用低溫保存箱(海爾公司);SB25-12DTS超聲波雙頻清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Bio-RadM680全自動酶標儀(上海一恒科技有限公司)。1.2方法1.2.1感染一半的mdv細胞ctid原代CEF用0.25%胰蛋白酶消化制成細胞懸液,計數后以1×101.2.2細胞維持液濃度根據中藥黃芩苷對CEF安全濃度的測定結果,將黃芩苷用細胞維持液自最大安全濃度起倍比稀釋5個濃度梯度,即312.5、156.25、78.13、39.06、19.53μg/mL。按下列分組分別加入到CEF中:1.2.2.1.黃鼠狼通過抑制細胞內病毒的轉移轉移對長成單層的原代CEF先接毒,將100TCID1.2.2.2.黃鼠狼實驗將黃芩苷按5個不同的稀釋濃度加入到CEF中,每個濃度4個復孔,每孔100μL,用透明膠帶將兩邊封口后,置5%CO1.2.2.3-黃酮對病毒的直接激活試驗直接播種將倍比稀釋的各濃度黃芩苷溶液100μL分別和等量效價為100TCID1.2.3采用mrt法觀察不同濃度的銀杏對mdv感染cef的影響將CEF濃度調節為最適,以細胞維持液調整使各孔培養液體積一致。置37℃、5%CO2結果與分析2.1MDVTCID經計算,MDV的TCID2.2抗黃疸藥物對mdv感染cef的影響2.2.1黃鼠狼通過抑制細胞內病毒的轉移轉移抑制試驗的結果由表1可知,黃芩苷質量濃度為312.5~78.13μg/mL時,A2.2.2黃鼠狼通過預防病毒感染細胞感染封鎖試驗的結果由表1可知,黃芩苷濃度為312.5~156.25μg/mL時,其A2.2.3黃鼠狼直接從病毒中殺死直接殺死由表1可知,黃芩苷濃度為312.5~78.13μg/mL時,其A3不同加藥途徑下病毒的抑制率本試驗以CEF為宿主細胞,建立了MDV感染CEF的模型,MDV感染的CEF出現了典型的病理變化,為細胞病變觀察法測定黃芩苷的效價提供依據。本試驗結果顯示MDV的TCID本試驗結果顯示,增殖抑制、感染阻斷、直接殺滅3種不同加藥途徑都在黃芩苷質量濃度為312.5~78.13μg/mL時,對病毒感染細胞具有抑制作用,增殖抑制(先接毒,后加藥)途徑對病毒感染細胞的抑制作用不如感染阻斷(先加藥,后接毒)和直接殺滅(藥毒同時加入)途徑。當黃芩苷質量濃度為312.5~78.13μg/mL時,3種加藥途徑下藥物的病毒抑制率均在50%以上,增殖抑制途徑的病毒抑制率最低,達到63.2%,直接殺滅途徑的病毒抑制率最高,達到109.6%,感染阻斷途徑的病毒抑制率質量濃度范圍最大。感染阻斷和直接殺滅途徑下,細胞存活率高于100%,即感染阻斷途徑下,黃芩苷質量濃度在312.5~156.25μg/mL時,黃芩苷不但能抑制病毒感染細胞,還能促進細胞的生長;直接殺滅途徑下,黃芩苷質量濃度在312.5μg/mL時,黃芩苷不但能抑制病毒感染細胞,還能促進細胞的生長。本試驗結果和其他研究報道的黃芩苷抗病毒效果具有相同的趨勢,如閆靜等