基因疫苗技術發展概況摘要基因疫苗已成為疫苗研究領域中的熱點之一，特別是其研究方向與世界衛生組織兒童疫苗長遠目標一一用一種疫苗預防多種疾病相吻合。從效力到成本的潛在優點已使基因疫苗成為今后疫苗制造的選擇，故澳大利亞昆士蘭醫學所的Waine和McManus在《ParasitologyToday》上論證，基因疫苗為第三次疫苗革命。令人鼓舞的是艾滋病和T細胞淋巴瘤的基因疫苗已進入到了臨床前階段，基因疫苗不僅能預防某些傳染病，還可做為治療用疫苗來治療一些復雜難治的疾病，例如病毒性肝炎、癌癥等，這些均已顯示出基因疫苗的巨大潛力和應用前景，但是，基因疫苗的歷史畢竟很短，實驗結果均來自動物，在用于人體之前還有許多工作必須完成，其中最重要的是解決基因疫苗對人體的安全性和效力問題。許多傳染病的控制、預防及治療，近代醫學發展中最輝煌的篇章，天花已經根絕，傷寒、結核、白喉、麻疹、乙型及丙型病毒性肝炎等的發病率和死亡率明顯降低，這些醫學成就從很大程度上應歸功于疫苗的研制與預防接種的普及。理想疫苗應具備的特征有：安全、廉價、熱穩定性好、含有多種具有保護作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前應用到人體的常規疫苗滅洋一個能完全滿足上述標準。因此，基因疫苗應運而生。將抗原基因重組到表達載體上，用一定方法導入到機體，它們在細胞內表達的抗原經過抗原呈遞激活機體免疫系統，誘導機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答，這種新的免疫方法叫做基因免疫，又稱之為核酸免疫或者DNA免疫。這類重組質粒疫苗稱為基因疫苗，也叫做核酸疫苗。基因疫苗被稱為第三代疫苗，具有廣闊的應用前景，受到世界各國科學家的重視。基因疫苗的發展史傳統上用于預防傳染病的疫苗有減毒知疫苗的滅活疫苗。前者如未充分減毒，可使接種者發生臨床型感染，而過分滅活或減毒的疫苗有可能不夠有效刺激宿主的免疫應答，難以獲得可靠的免疫防護，故而人們迫切希望找到一種新的安全有效的疫苗。1990年Wolffetal試圖用注射方法促使小鼠的肌細胞吸收質粒DNA以產生新的蛋白質.對照組在注射DN時未加任何化學佐劑，出人意料的是對照組動物的肌細胞吸收了這種裸露的質粒DNA后，能高水平地表達外源蛋白.Tangetal于1992年將人生長激素基因的質粒DNA導入小鼠表皮細胞后,在小鼠血清中可檢測到特異的抗人生長激素抗體，從而提出基因免疫的概念.隨后人們在魚、雞、大鼠、兔、豬、牛、雪貂、猴和黑猩猩的骨骼肌以及大鼠的心肌中注射裸露DNA，均能觀察到外源蛋白的持續表達.而且在部分研究中證實，此途徑引起的免疫應答對野生病毒的攻擊具有保護作用.這此研究表明，直接給動物接種編碼抗原的基因片段可使該動物獲得對該抗原的免疫力,即將編碼某種蛋白的處源基因直接導入動物細胞可達到免疫接種的目的.這一基因免疫接技術的出現,為新型疫苗的研制開路了一條嶄新途徑.所接種的核酸(DNA或RNA)既是載體，又是抗原的來源，具有疫苗的功能，可稱為基因疫苗或核酸疫苗.基因疫苗的作用機制基因疫苗一般由病原體抗原編碼基因和以真核細胞作為表達載體的質粒構成.抗原編碼基因可以是完整的一組基因或單個基因的cDNA；也可以是編碼抗原決定簇的一段核酸序列.總之，其表達產物為病原體的有效抗原成分，可引起保護性免疫.載體質粒多以pBR322或pUC質粒為基本骨架,帶有細菌復制子(ori)，能在大腸桿菌內高效穩定的復制，但缺乏在哺乳動物細胞內復制的能力.質粒載體所帶啟動子多來源于病毒基因組，如CMV、RSV和鼠白血病病毒長臂末端重復序列(LTR)等啟動子.此類啟動子具有較強的轉錄激活作用，能保證抗原基因在真核細胞內有效表達并引起免疫應答.基因疫苗激活免疫系統的詳細機制尚不十分清楚.一般認為,含病原體抗原基因的核酸疫苗被導入宿主骨骼肌細胞或皮膚細胞后，可在細胞內表達病原體的蛋白質抗原,經加工后形成的多肽抗原可與宿主細胞MHCI類和II類分子結合，并被提呈給宿主的免疫識別系統，從而可引起特異性體液和細胞免疫應答.肌細胞吸收和表達處源DNA的效力較高,這可能與肌細胞本身的結構特點有關.肌細胞可形成多核細胞,含有肌質網;骨骼肌和心肌還具有T小管系統,該系統含有細胞外液并能伸入到細胞內部Wolffetal發現組織培養的肌細胞T小管和細胞膜穴樣內陷可將質粒納入.Vahlsingetal認為,肌細胞可能作為一種中心成分直接參與誘導免疫應答.例如，流感病毒NP基因只有在肌細胞內表達并分泌到胞外,才能刺激機體產生抗-NP抗體,介導體液免疫應答；而經肌細胞蛋白酶加工處理后的NP則可在MHCI類分子的限制下提呈給T淋巴細胞，導致體內CTL應答.所需刺激信號來源于肌細胞本身，或者來源于注射引起的損傷區域的浸潤細胞.另一種觀點是，肌細胞的直接參與并非必需,NP從肌細胞分泌出來后,被巨噬細胞和(或)樹突狀細胞吞噬、處理、提呈、分別在MHCI和I類分子的限制下，誘導CTL前體、B細胞和特異性Th細胞.還有一種解釋是用DNA免疫時，肌細胞和抗原呈細胞(APCs)均被轉染，引起CD4+、CD8+T細胞亞群的同時活化，從而產生特異性細胞免疫應答.4基因疫苗的特點基因疫苗與傳統疫苗相比，具有以下特點:(1)直接DNA接種:避免了制備傳統疫苗的繁瑣過程；(2)基因疫苗接種后蛋白質抗原可直接與MHCI類和I類分子結合形成免疫復合物，與減毒活疫苗或載體活疫苗一樣能引起CTL反應,但不存在后者的毒力回升等危險;(3)基因免時產生的抗原多肽的提呈過程和自然感染時相似，以其天然構象被提呈給免疫識別系統,此一特性對于構象型抗原表位引起的保護性免疫尤為重要，而用目前的重組技術在體外合成的蛋白抗原常造成構象型抗原表位的改變或丟失；(4)基因疫苗具有共同的理化性質為聯合免疫提供了可能;(5)作為一種重組質粒,基因疫苗能在大腸菌工程菌內快速增生，且提取純化簡便，可大幅度降低成本，省時省力;(6)可以同種異株交叉保護.選擇某一種病原體的編碼保守蛋白的核酸序列作為基因疫苗，因其不會變異,故可對同一種病原體的變異型或新型產生交叉免疫，從而起到免疫保護作用.這是基因疫苗突出的優點之一.(7)受宿主預存免疫性(pre-existingimmunity)的影響很小，這是基因疫苗無可比擬的優點之一;(8)基因疫苗不僅可用于預防，還可用于治療.基因疫苗的安全性是人們關心的重要問題.在理論上存在導入的外源DNA整合入宿主細胞基因組的可能，并導致細胞癌基因的順式或反式激活、抗癌基因的失活等,使細胞發生惡性轉化.但通過甲基化分析、酶切分析和PCR等技術的研究結果表明，進入骨骼肌細胞的DNA分子獨立存在于細胞質中，未發現復制或整合.另一問題是有可能引起抗-DNA抗體和自身免疫性疾病.但Robertson最近研究表明,裸露的雙鏈DNA分子很難引起抗-DNA抗體反應.然而，正如Spier(1995年)指出的那樣,我們對基因免疫的機制還遠未了解,其安全性有待進一步驗證,今后的道路還很長.5.1流感DNA疫苗1993年Robinsonetal直接將編碼流感病毒血凝素(HA)的DNA肌注小雞和小鼠,結果這些動物產生了抗HA特異性抗體并能抵抗嗣后致死劑量流感病毒的攻擊.后來其用DNA滴鼻接種，能誘導呼吸道黏膜抗病毒的免疫保護作用.甲型流感病毒經常發生變異，從而逃避免疫系統的監視，使原有的疫苗對新毒株不起作用.1993年Merck研究室的Ulmeretal選擇甲型流感病毒中序列保守的核蛋白(NP)基因制備DNA疫苗.將高度保守的流感病毒A/PR/8/34株的NP編碼基因接種在Rous肉瘤病毒或CMV的啟動子的控制下.將質粒直接注射BALB/C小鼠四頭肌后,NP基因在小鼠內轉錄成mRNA后表達NP蛋白.在致死劑量同型病毒異源毒株A/HK/68或A/PR/8/34株(兩株為不同亞型,分離時間相隔34a)的攻擊下,免疫小鼠的存活率為90%，而注射空白載體(無NP序列)的小鼠存活率為0,未注射的小鼠存活率為20%.經純化的NP蛋白免疫后產生抗-NP蛋白抗體的小鼠以及輸入高效價的抗NP抗體小鼠，均不能抵抗病毒攻擊,說明抗-NP蛋白抗體介導的體液免疫無效，而CTL介導的細胞免疫則能防御動物感染流感病毒，可見基因疫苗的作用機制與傳統疫苗不同:編碼NP的外源DNA在宿主細胞內表達,可產生NP蛋白,經加工處理后與MHCI類分子形成復合物，提呈到細胞表面,CTL能加以識別并發揮殺傷作用.此種疫苗可抵抗發生顯著變異的各型甲型流感病毒.5.2艾滋病DNA疫苗1993年Wistar研究所的科學家給小鼠和非人靈長類動物的肌肉注射含有HIV-1包膜蛋白(env)基因的質粒PM160,結果產生了抗HIV-1(env)的特異性抗體，他能中和HIV-1的感染，在體外能抑制HIV-1介導的合胞體形成以及CD4與gp120結合.同時還觀察到特異性T細胞和CTL應答，表明HLV-1envDNA可在宿主肌細胞內表達和加工.表達產物gp160被切割成gp120和gp41后，可折疊成天然結構，從而誘導全面的免疫反應.誘生的特異性抗體不僅可與gp120和gp41結合，還能與tat、tev基因產物反應，這是mRNA發生剪接的結果.美國Agracetus公司正在非人靈長類動物中試驗HIV和猿猴免疫缺陷癥病毒(SIV)gp120亞單位疫苗,預計進入人體試驗至少還需1a.質粒DNAgp120和重組DNAgP120不同,后者為細胞外傳遞，而前者由細胞內表達產生.因此，雖然gp120疫苗在其他系統中效果不佳，但其DNA疫苗可能有效.研制艾滋病疫苗的最大障礙之一就是HIV是一種變異率極高的RNA病毒,對某些HIV株有效的疫苗對同時大量存在的變異株可能完全無效上述流感疫苗的研究結果給艾滋疫苗的研究提供了一條新思路,HIV包膜蛋白變異性很大，這與流感病毒相似，但其核心蛋白高度保守.因此，通過基因疫苗方法將HIV-CcDNA導入體內，表達C蛋白后，借助CTL介導的細胞免疫，能否預防HIV感染，頗值得探索.同理，也為目前面臨困境的丙型肝炎疫苗研制提供一條新思路,具有一定指導意義.5.3狂犬病DNA疫苗狂犬病病毒(RV)糖蛋白與RV的致病性有關，又可誘生保護性中和抗體.1994年Xiangeta將編碼RV糖蛋白的cDNA插入質粒DNA，在AV40早期啟動控制下表達.用該質粒CAN直接注射小鼠腓腸肌，免疫3次，間隔2-3wk,150gg/次,免疫后小鼠產生了抗-PN中和抗體、抗-PV糖蛋白特異性CTL和分泌淋巴因子的Th細胞，末次免疫后2wk用半數致死量(LD50)病毒標準株(CVS)攻擊，結果均獲得完全保護;而用空白載體質粒免疫的對照組在相同劑量攻擊下14d內全部死亡.5.4乙型肝炎DNA疫苗由于HBV變異及宿主免疫耐受等因素，使乙肝疫苗接種可能失敗，給乙肝預防帶來困難.基因疫茵能否解決這些問題，值得研究.Davis和Whalen已在小鼠中證明含編碼HBsAg及preS基因并有真核細胞啟動子的重組質粒DNA免疫，可誘生抗-HBS和致敏CTL產生.最近，在黑猩猩中進行的實驗說明，用2mg裸DNA作肌肉注射，一次免疫力后即可誘生抗HBs達100mIU/mL.再刺激后，抗-HBsm效價可達14000mIU/mL然而僅用400gg的HBV-DNA免疫則一