組織化學技術概述

(人體解剖與組織胚胎學系)1ppt課件一.組織化學的定義組織化學（histochemistry）技術是通過化學或物理反應原理顯示組織切片或細胞內某種化學成分，進行定位、定量及其與功能相關的研究。2ppt課件

隨著科學技術的不斷發展，組織化學在近幾十年來已經得到了迅速的發展，產生了許多分支，如核酸與蛋白質、蛋白質與氨基酸、脂類與蛋白質、碳水化合物與粘蛋白及粘多糖、無機物組織化學、酶組織化學、電鏡組織化學、熒光組織化學、免疫組織化學、同工酶組織化學、定量組織化學、原位雜交組織化學和放射自顯影技術等。因此，現代組織化學的概念已經大大的超過了以往的范疇，無論從理論、內容、研究手段、研究范圍都比以往更廣泛及更深入。二.組織化學的研究概況3ppt課件

應用組織化學技術（histochemicaltechnics）,顯示組織細胞內的各種化學物質和代謝狀態。光鏡組織化學技術(microscopichistochemicaltechnics)所顯示的組織化學物質，是呈色反應(stainingrection)，呈色反應的強或弱，表示組織細胞內化學物質含量的多少。酶組織化學(enzymehistochemical)，所顯示酶的呈色反應的強或弱，也稱酶活性反應(enzymeactiverection)。光學顯微鏡下所見的組織化學呈色反應也稱陽性反應(positiverection)。

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電子顯微鏡組織化學技術(electronmicroscopichistochemicaltechnics)，是在電鏡觀察時，所顯示的化學物質，呈現出的電子密度(ectrondendity)高或低即表明所含量的程度，或酶的活性強、弱。光鏡和電鏡組織化學，均可對所顯示的化學物質和酶類，在組織細胞內，進行定性、定量和定位觀察。

5ppt課件三.組織化學研究的內容酶類、糖類、脂肪、核酸、蛋白質等

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酶（Enzyme）酶（Enzyme）是具有催化功能的一種特殊蛋白質，人體的各種機能活動都與酶的活性有密切關系，生物體內的一切新陳代謝活動都是在酶的催化作用下進行的。因此，酶在機體內的各種反應和鑒定手段涉及到各種基礎學科，如組織、生理、生化和病理等已成為日益為人們所重視的內容之一。7ppt課件（一）酶的分類

1．水解酶

2．氧化還原酶

3．轉化酶

4．連接酶

5．裂解酶

6．異構酶8ppt課件（二）酶的組織化學反應法

1．偶氮染料法

2．吲哚酚法

3．金屬---金屬鹽法

4．氧化-還原反應法

5．色素形成法

9ppt課件酶類

酸性磷酸酶

Holt與Bitensky改良磷酸鉛法

Gomori與McDonedel硫化鉛法

堿性磷酸酶

Gomori-Takamatsu法

Gomori改良鈣鈷法

Gomori萘酚磷酸酯法

琥珀酸脫氫酶

Nachlas硝基藍四唑法

Pearson二甲亞砜法

過氧化物酶

Graham-Karnovsky法

Vitale辣根過氧化物酶

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酸性磷酸酶（AcidPhosphatase,ACP）廣泛分布于機體組織中，它主要位于溶酶體中，也有少量在內質網中。巨噬細胞、前列腺、空腸上皮紋狀緣、肝、脾、腎及腎上腺等尤為豐富。11ppt課件Holt與Bitensky改良磷酸鉛法

作用原理

試劑配制

染色方法

對照

結果

12ppt課件

作用原理在酸性PH值的情況下，給切片加入甘油磷酸酯（或任何磷酸單酯），如有酸性磷酸酶，則釋放磷酸酯，后者與高濃度的Pb2+結合，形成無色的磷酸鉛，經硫化胺（或硫化氫）作用，磷酸鉛轉變為黑色硫化鉛：甘油磷酸酯磷酸酯+鉛磷酸鉛硫化鉛酸性磷酸酶13ppt課件試劑配制①孵育液在400ml0.05M醋酸緩沖液（PH值5.0）中加入0.53g硝酸鉛及40ml3%的β-甘油磷酸鈉溶液，在37℃放置24h產生一些沉淀物，冷卻后過濾，過濾后立即使用。②硫化氫液用濃硫酸作用于硫化鋅或硫化鐵，所產生的硫化氫氣體用通過很稀的鹽酸洗去氣體中的雜質后，再通過50ml蒸餾水中，每分鐘通過120個氣泡的速度10min即可。14ppt課件染色方法①未固定的新鮮組織用恒冷切片機切片；②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的組織孵育的時間不同；③充分蒸餾水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的鉛；④切片入硫化氫液10～60s；⑤充分蒸餾水洗；⑥在甘油明膠封固劑中封固。15ppt課件對照片在孵育液中加入0.01M氟化鈉。結果

硫化鉛沉淀為黑色或棕色的沉淀

16ppt課件

堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,ALP）廣泛存在于機體組織，常見于具有活躍轉運功能的細胞膜內，如毛細血管及小動脈的內皮，肝內膽小管膜，腎近曲小管的刷狀緣，腎上腺、膀胱、脾臟內皮細胞以及乳腺和卵巢中。顯示堿性磷酸酶的方法有多種，最常用的是金屬沉淀的鈣鈷法。17ppt課件Gomori-Takamatsu法

作用原理

試劑配制

染色方法

結果

注意事項18ppt課件作用原理在PH9.4及Ca2+存在的情況下，給切片加入甘油磷酸酯（或任何磷酸單酯），如有堿性磷酸酶，則釋放磷酸酯，后者與高濃度的Ca2+結合，形成無色的磷酸鈣，經硝酸鈷處理后，磷酸鈣轉變磷酸鈷，再經硫化胺作用，磷酸鈷轉變為黑色硫化鈷：甘油磷酸酯磷酸酯磷酸鈣硫化鈷（黑色）磷酸鈷堿性磷酸酶+Ca2++Co2+19ppt課件試劑配制①

作用液

2%巴比妥鈉（5，5-二乙基巴比妥鈉）10ml3%β-甘油磷酸鈉10ml2%無水氯化鈣10ml2%硫酸鎂1ml蒸餾水5ml本液PH值為9．4。②對照液在上述液中用10ml蒸餾水代替3%β-甘油磷酸鈉。20ppt課件染色方法①將未固定的組織在恒冷切片機切片；②用新配制的作用液（孵育液）孵育切片，37℃，10min（切片8μm厚）；③流水沖洗5min；④入2%硝酸鈷溶液中5min；⑤蒸餾水洗；⑥入0.5%的硫化氨液1min；⑦蒸餾水洗；⑧甘油明膠液封固。（4）結果硫化鈷的黑色沉淀表示酶活性。21ppt課件22ppt課件

琥珀酸脫氫酶（SDH）是屬于琥珀酸氧化酶系統的酶，也是普通的酶類之一，是三羧酸循環中一個很重要的酶。它存在于所有有氧呼吸的細胞，其中以心肌、腎小管曲部上皮細胞及肝細胞含量最豐富，它牢固結合于線粒體膜內，最適PH值為7.6。此酶對固定劑很敏感，因此，要求新鮮組織低溫恒冷切片。Nachlas硝基藍四唑法結果琥珀酸脫氫酶活性部位呈藍紫色顆粒Pearson二甲亞砜法結果酶活性表現為藍紫色沉淀23ppt課件過氧化物酶Mcjunkin過氧化物酶顯示法1原理：過氧化物酶催化的反應中有兩種底物，即受氫體和供氫體，前者的代表為過氧化氫，后者的代表為聯苯胺系列的試劑。細胞內的過氧化物酶氧化聯苯胺而呈藍色或棕色，根據顏色的反應深淺確定酶的含量。2操作步驟：新鮮小塊組織固定于10%的甲醛溶液8小時；入70%丙酮1小時，純丙酮30分鐘；經二甲苯透明，石蠟包埋，切片5um；脫蠟經丙酮至水，入過氧化物酶作用液5分鐘；聯苯胺100ml80%甲醇25ml3%過氧化氫2滴用前加1~2倍蒸餾水稀釋，保存于暗處。蒸餾水速洗，入Harris蘇木精2分鐘，水洗，入依紅染20秒鐘；脫水、透明、封片。

3結果：過氧化物酶呈藍色顆粒24ppt課件25ppt課件多糖類

凡化學結構上含有糖分子的物質都稱多糖類。多糖類物質分布很廣，其中主要的有糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白和糖脂類。在機體內很多組織，如肝、肌肉、消化道、呼吸道和唾液腺的上皮粘液、甲狀腺濾泡膠質、軟骨基質、垂體嗜堿性細胞、基底膜、真菌、纖維蛋白、膠原纖維和中樞神經系統等都含有糖。有較多的方法可以顯示多糖類的成分。最常用的有：

過碘酸-Schiff反應

PAS—阿爾辛藍法

26ppt課件過碘酸-Schiff反應

作用原理試劑配制染色方法

結果注意事項27ppt課件

作用原理

糖原、多糖和糖蛋白等都可用過碘酸-Schiff反應（PAS反應）來顯示。其原理是通過過碘酸的氧化作用，將糖分子中的碳鍵打斷，游離出醛基，與無色堿性品紅反應顯示出紅色。

試劑配制①過碘酸氧化液高碘酸0.5g，蒸餾水100ml。此液溶后冰箱中待用。②Schiff液堿性復紅1g1N鹽酸20ml

偏重亞硫酸鈉1g雙蒸餾水200ml

先將200ml雙蒸餾水煮沸，稍有火焰，加入1g堿性復紅，再煮沸1min。冷卻至50℃加入20ml1N鹽酸，待35℃時加入2g偏重亞硫酸鈉。室溫中2h之后見稍帶紅色，5h之后變為無色液體。棕色瓶內裝好，封口，放入冰箱中保存待用。28ppt課件

染色方法①組織切片，脫蠟至水；②蒸餾水洗；③入過碘酸氧化液10～20min；④充分蒸餾水洗；⑤Schiff液染色10min（如果室溫在15℃以下可稍加溫以加快反應）；⑥流水沖洗10min（對著色較深顏色的切片可縮短時間）。⑦可用Mayer明礬蘇木素液染核3～5min；⑧0.5%鹽酸乙醇分化；⑨無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。29ppt課件

結果

PAS反應陽性產物呈紅色，細胞核藍色。幻燈片23

注意事項①為避免多糖類物質溶解，不用水溶性固定劑。對于糖原的固定，則需選用Carnoy等固定液。②偏重亞硫酸鈉需質量優良，不能使用陳舊無硫的刺激性氣味的藥品。③染了Schiff液后，不可用自來水沖洗過久，防止返紅。切片變紅適中后應立即封片。30ppt課件31ppt課件脂肪

很多細胞都含有脂肪。游離狀態的脂肪呈小滴狀懸浮于細胞內，比較顯著的如肝細胞。脂肪小滴可以集合成大滴，將細胞質及細胞核擠在一旁，如脂肪細胞。脂肪不溶于水，只溶于脂肪溶劑如濃乙醇、乙醚、氯仿、二甲苯、苯等，因此脂肪標本的制作，需要不能溶解脂肪的液體固定，也不用石蠟或火棉膠包埋，而用冰凍切片或明膠包埋—冰凍切片。脂肪染色法有多種，常用的有：蘇丹Ⅲ染色法

蘇丹Ⅳ染色法

油紅染色法32ppt課件蘇丹Ⅳ染色法作用原理蘇丹染色脂肪的機制一般認為是物理學上的溶液作用或吸附作用。蘇丹Ⅳ染液的配制染色方法

結果脂類物質呈桔紅色，細胞核呈藍色。33ppt課件34ppt課件核酸

Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法

Cook甲基綠-派洛寧法

35ppt課件Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法：

作用原理

Schiff試劑配制染色方法

結果

注意事項36ppt課件

作用原理脫氧核糖核酸通