微生物遺傳變異和菌種保藏第一節遺傳的物質基礎三個經典實驗：轉化實驗噬菌體的感染實驗植物病毒的重建實驗2微生物遺傳變異和菌種保藏實驗材料：實驗方法：動物實驗細菌培養實驗S型菌無細胞抽提液試驗（一）轉化實驗Griffith（1928）Avery（1944）3微生物遺傳變異和菌種保藏實驗材料：肺炎雙球菌光滑型（S）粗糙型（R）有莢膜菌落光滑分泌毒素致病無莢膜菌落粗糙無毒不致病SⅠSⅡSⅢ三個血清型RⅠRⅡRⅢ三個血清型4微生物遺傳變異和菌種保藏活死死加活R菌或死S菌加活S菌加活R菌和熱死S菌抽血分離活的S菌轉化實驗（1）動物實驗?5微生物遺傳變異和菌種保藏ＳⅢ〖熱死〗

無菌落生長

體外培養

ＲⅡ〖活菌〗

體外培養

ＲⅡ菌落

ＲⅡ菌落多ＳⅢ菌落少

體外混合培養ＳⅢ〖熱死〗

ＲⅡ〖活菌〗

說明：加熱殺死的S型細菌中可能存在某種物質，能通過某種方式進入R型細菌。轉化實驗（2）細菌培養實驗6微生物遺傳變異和菌種保藏大量R菌落活R菌S菌無細胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+說明：遺傳因子是以DNA為物質基礎。轉化實驗（3）S型菌無細胞抽提液試驗7微生物遺傳變異和菌種保藏（二）噬菌體的感染實驗8微生物遺傳變異和菌種保藏吸附10分鐘后攪動離心上清液沉淀離心,分出上清液和沉淀.沉淀細胞進一步培養，產生大量的子代噬菌體(30%P32、

1%Ｓ35

）。證明：在其DNA中，含有包括Pro外殼在內的整套遺傳物質。9微生物遺傳變異和菌種保藏

植物病毒蛋白質和RNA可以人為地分開,同時又可把它們重新組合成具感染性的病毒.甲ＲＮＡ＋乙Ｐr→感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒乙ＲＮＡ＋甲Ｐr→感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒（三）植物病毒的重建實驗

TMV:煙草花葉病毒HRV:霍氏車前花葉病毒（RNA)證明遺傳物質是RNA10微生物遺傳變異和菌種保藏TMVHRVHRVTMV原始株拆開重建感染分離純化植物病毒的重建實驗

11微生物遺傳變異和菌種保藏第二節基因突變及修復一基因突變二DNA損傷的修復12微生物遺傳變異和菌種保藏一基因突變（一）突變類型（二）突變的特點13微生物遺傳變異和菌種保藏（一）突變類型1堿基變化與遺傳信息的改變2表型變化14微生物遺傳變異和菌種保藏1堿基變化與遺傳信息的改變（1）錯義突變（missensemutation）：某個密碼的第一個堿基或第二個堿基發生轉換或顛換，使編碼某一氨基酸的密碼變為編碼另一個氨基酸的密碼。氨基酸置換（2）無義突變（nonsensemutation）：某個密碼的第一個堿基或第二、第三個堿基發生轉換或顛換，變為不編碼任何氨基酸的密碼。終止密碼子（UAA,UAG,UGA)。（3）同義突變（samesensemutation）：發生改變的堿基位于密碼的第3位，一般編碼同一個氨基酸。比如簡并密碼。編碼的氨基酸與野生型氨基酸相同。（4）移碼突變（frameshiftmutation）：DNA序列中1-2個核苷酸缺失或插入，翻譯的閱讀框改變，導致氨基酸序列改變。15微生物遺傳變異和菌種保藏2表型變化（1）營養缺陷型（2）抗藥性突變型（3）條件致死突變型（4）形態突變型16微生物遺傳變異和菌種保藏（1）營養缺陷型(auxotroph)▲由于代謝障礙成為必須添加某種物質才能生長的突變株。▲

腺嘌呤突變株Ade-（完全培養基）腺嘌呤野生型菌株Ade+（基本培養基和完全培養基）。▲營養缺陷型是微生物遺傳學研究中重要的選擇標記和育種的重要手段。▲用影印平板進行分離篩選。17微生物遺傳變異和菌種保藏完全培養基基本培養基完全培養基18微生物遺傳變異和菌種保藏（2）抗藥性突變型（resistantmutant)由于基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產生抗性的一種突變型。在加有相應抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。19微生物遺傳變異和菌種保藏▲在某一條件下具有致死效應，在另一條件下沒有致死效應。▲合成關鍵性酶的基因發生了突變。▲

如溫度敏感突變ts（42℃致死，25℃~30℃存活）。▲用影印平板進行分離篩選。（3）條件致死突變型（conditionallethalmutant）20微生物遺傳變異和菌種保藏細胞形態突變

菌落形態突變顏色突變噬菌斑形態突變（4）形態突變型（morphologicalmutant）包括21微生物遺傳變異和菌種保藏（二）突變的特點1非對應性：環境與變異無對應性。2自發性：非人為的誘變因素下發生。3規律性：某一特定性的突變率具規律性。4獨立性：一個基因的突變對其它基因突變無影響。5稀有性：生物自發突變率為10-6～10-12。6誘變性：誘變劑可提高突變率10~105×。7穩定性：突變性狀穩定、可遺傳。8可逆性：有回復突變。22微生物遺傳變異和菌種保藏二DNA損傷及修復（自學）1光復活作用（Photoreactivation）2切除修復（ExcisionRepair）3重組修復（RecombinationRepair）4SOS修復（SOSRepair）23微生物遺傳變異和菌種保藏光復活作用（Photoreactivation）ThymineDimer24微生物遺傳變異和菌種保藏Photoreactivation光解酶Phr在黑暗中專一地識別嘧啶二聚體，并與之結合，形成酶-DNA復合物，當有光時，酶利用光能將二聚體拆開，恢復原狀，酶再釋放出來。25微生物遺傳變異和菌種保藏正常可見光下光誘導系統的修復。photoreactivationenzyme光裂合酶photolyase烷基轉移酶Alkyltransferases切割嘧啶二聚體，分開。胸腺嘧啶二聚體光復活酶可見光光的吸收酶的釋放光復活過程26微生物遺傳變異和菌種保藏第三節基因重組一、原核生物的基因重組二、真核生物的基因重組27微生物遺傳變異和菌種保藏基因重組§把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經遺傳物質重新組合后，形成新遺傳型個體的方式。§基因重組——分子水平的雜交§一般雜交——細胞水平如：

甲

乙生長快、產量低生長慢、產量高

基因重組

生長快、產量高28微生物遺傳變異和菌種保藏一原核微生物的基因重組（一）轉化（transformation)（二）轉導(transduction)（三）接合(conjugation)29微生物遺傳變異和菌種保藏（一）轉化（transformation)概念——

受體細胞(receptor)直接吸收來自供體細胞(donor)的DNA片斷，并把它整合到自己的基因組中，細胞部分遺傳性狀發生變化的現象叫轉化。

1.感受態2.感受態因子3.轉化因子4.轉化的特點30微生物遺傳變異和菌種保藏

（1）感受態：受體細胞最易接受外源DNA片段并實現其轉化的一種生理狀態。（2）轉化的決定因素：不同菌株的親緣關系;受體細胞是否處于感受態；不同菌出現感受態的時間不同。（3）感受態的獲得：自然獲得；用CaCl2處理細胞；電穿孔1.感受態31微生物遺傳變異和菌種保藏細菌自身分泌的一種胞外蛋白質，分子量為5～10kD。其作用為：（1）催化轉化，促進外來DNA片段吸收。（2）可降解細胞表面某種成分，使DNA受體暴露。

§不同菌細胞DNA受體位點不同。

§有的菌感受態因子只對同種菌起作用。2.感受態因子32微生物遺傳變異和菌種保藏3.轉化因子（1）

轉化因子由供體提供。（2）

一般為線狀或閉合環狀；單鏈或雙鏈；雙鏈ＤＮＡ有轉化能力，單鏈沒有。（3）

自然情況下可由細菌細胞自行裂解產生；實驗室里通過提取獲得。（4）

轉化的頻率往往很低，一般為0.1～1%。據研究，呈質粒形式（雙鏈閉合環狀）的轉化因子，其轉化頻率最高。游離的ＤＮＡ片斷叫轉化因子。33微生物遺傳變異和菌種保藏4.轉化的特點不需兩個細胞直接接觸，供體DNA提取出來，注入受體即可。34微生物遺傳變異和菌種保藏在細菌的感受態出現時，具有從周圍環境吸收DNA分子而不被DNA酶破壞的生理特性。處于感受態的細胞，吸收DNA的能力有時可比一般細胞大1000倍。35微生物遺傳變異和菌種保藏36微生物遺傳變異和菌種保藏（二）轉導(transduction)以溫和噬菌體為媒介，把供體細胞的DNA或RNA片斷轉移到受體細胞中，從而使后者獲得前者的部分遺傳性狀。不需要細胞間直接接觸。但需要媒介。37微生物遺傳變異和菌種保藏

普遍轉導（GeneralizedTransduction）

噬菌體可以轉導供體染色體的任何部分到受體細胞中。

局限轉導（SpecializedTransduction）

噬菌體總是攜帶同樣的片段到受體細胞中。38微生物遺傳變異和菌種保藏結果10-5頻率出現野生型菌株。（基本培養基）U型管試驗：也能出現野生型菌株（基本培養基）在對鼠傷寒沙門氏菌營養缺陷型菌株的研究中發現A+B-A-B+A+B+A+B+39微生物遺傳變異和菌種保藏供體A-B+A+B-多數受體形成溶源菌A-B+A+B-少數受體A+B+經重組形成轉導子A:組氨酸B:色氨酸GeneralizedTransduction40微生物遺傳變異和菌種保藏SpecializedTransduction▲

被轉導的基因與噬菌體DNA共價連接，與噬菌體DNA一起進行復制包裝以及導入受體細胞。▲

噬菌體攜帶特殊的染色體片段將固定的個別基因導入受體。普遍轉導和局限轉導的不同之處：41微生物遺傳變異和菌種保藏SpecializedTransduction原噬菌體供體DNA受體DNA42微生物遺傳變異和菌種保藏（三）接合(conjugation)概念：供體細胞與受體細胞直接接觸，借性菌毛傳遞大段DNA的過程。在受體細胞中發生交換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的現象，稱為接合。

通過接合而獲得新性狀的受體細胞就稱接合子。43微生物遺傳變異和菌種保藏+A+B+C-D-A-B-C+D+接合及其發現（大腸桿菌）A+B+C+D+A:生物素B:甲硫氨酸C:蘇氨酸D:賴氨酸基本培養基A+B+C-D-A-B-C+D+44微生物遺傳變異和菌種保藏Davis（1950）U型管試驗兩個菌株不能直接接觸，只能是培養液和營養物質（包括DNA分子）可以通過。完全培養基完全培養基A+B+C-D-A-B-C+D+基本培養基沒有菌生長45微生物遺傳變異和菌種保藏1.F+與F-雜交F+細菌的表面有稱作性菌毛（sexpili）的細長菌毛，由此與F－細菌接合，一旦接觸后，菌毛發生改變，成為兩細胞間的原生質通道----細胞質橋或稱結合管（conjugationtube），F+細胞的F因子通過接合管向F－細胞轉遞：使F－變成F＋，F因子還可改變細胞表面的構造，以防F＋細胞間的接合。F+細菌：含有F因子F-細菌：不含有F因子F因子就是F質粒。46微生物遺傳變異和菌種保藏滾環式復制，σ式47微生物遺傳變異和菌種保藏48微生物遺傳變異和菌種保藏2.Hfr×F-雜交Hfr菌的形成——

F質粒整合到細菌染色體上。49微生物遺傳變異和菌種保藏質粒和染色體共有插入序列和轉座因子。這些轉座因子之間的同源重組導致質粒的整合。50微生物遺傳變異和菌種保藏Hfr×F-雜交結果仍是Hfr細胞和F-細胞。51微生物遺傳變異和菌種保藏Hfr和F+的聯系和區別

聯系：（1）都是雄性菌，含有F質粒。（2）Hfr——F質粒與染色體整合。

F+

——

F質粒游離在染色體外。區別：（1）Hfr

的F質粒轉移頻率低，F+

的F質粒轉移頻率高；（2）Hfr

的F質粒整合，F+

的F質粒游離。52微生物遺傳變異和菌種保藏3.F’

轉導F’

因子攜帶有宿主染色體基因的F因子。從Hfr菌中染色體上脫離下來的F質粒有時會攜帶相鄰的染色體基因或DNA片段，稱為F’質粒（F’因子），該菌被稱為F’菌。F’因子53微生物遺傳變異和菌種保藏§給體的部分染色體基因隨F’一起轉入受體細胞。基因不需整合就可表達。§利用F’因子形成部分二倍體叫做性導sexduction。F’×F-雜交54微生物遺傳變異和菌種保藏注意區別F+菌、Hfr菌、F’

菌的不同！55微生物遺傳變異和菌種保藏轉化、轉導、接合三者的根本區別

在于DNA轉移的方式不同轉化：供體DNA片斷→注入受體細胞，通過細胞膜接合：供體進入受體通過性菌毛。轉導：供體DNA片斷通過媒介－噬菌體攜帶進入受體。56微生物遺傳變異和菌種保藏二真核微生物的基因重組（一）有性生殖（二）準性生殖（parasexualhybridization）（三）酵母菌的接合型遺傳57微生物遺傳變異和菌種保藏（一）有性生殖一般指性細胞間的接合和隨之發生的染色體重組，并產生新遺傳型后代的一種生殖方式。凡是能產生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物有性生殖相似的方法進行有性繁殖。一部分真菌的減數分裂發生在1個閉合的子囊殼中，具較短的生活周期，為遺傳重組的研究帶來極大方便。58微生物遺傳變異和菌種保藏子囊孢子形成過程粗糙脈胞霉：1個子囊內產生的雙倍體核直接減數分裂后所產生的4個孢子直線排列在子囊內（為順序排列四分體），再進行一次有絲分裂，產生8個子囊孢子。AAAAaaaa、aaaaAAAA、AAaaAAaaaaAAaaAA、AAaaaaAA、aaAAAAaa8個子囊孢子的排列：59微生物遺傳變異和菌種保藏粗糙脈胞霉（面包霉）的生活史分生孢子（n）菌絲（n）子實體核融合合子核(2n)交配型A交配型B減數分裂I減數分裂II有絲分裂萌發(n)子囊孢子（n）60微生物遺傳變異和菌種保藏粗糙脈胞霉減數分裂61微生物遺傳變異和菌種保藏62微生物遺傳變異和菌種保藏（二）準性生殖（parasexualreproduction）1.準性生殖2.準性生殖的意義3.過程63微生物遺傳變異和菌種保藏1準性生殖

同種異株的兩個體細胞融合，不經減數分裂而導致低頻基因重組發生的一種繁殖方式。（單倍體體細胞重組）準性生殖與有性生殖的不同：

▲重組體細胞和一般營養體細胞外形沒有不同，不產生在特殊的囊器中。▲染色體的交換及單倍體化過程沒有規律性。64微生物遺傳變異和菌種保藏2準性生殖的意義▲對一些沒有有性過程但有重要生產價值的半知菌來說，進行基因在染色體上定性研究、雜交育種，準性生殖提供了一個重要的手段。▲發現存在于構巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放線菌中，使之有普遍意義。65微生物遺傳變異和菌種保藏3準性生殖的過程（1）菌絲聯結（anastomosis）;（2）形成異核體（heterocaryon）;細胞質、細胞核交流形成異核菌絲體。（3）核配（caryogamy)形成雜合二倍體;特點：頻率低，10-5～10-7

促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫。（4）體細胞交換和單倍體化66微生物遺傳變異和菌種保藏異核體同時具有二種或二種以上不同基因型核在同一細胞質中，這種現象又叫異核現象。同核體同一菌絲中只有一種核。

67微生物遺傳變異和菌種保藏體細胞交換和單倍體化

體細胞交換：

雜合二倍體細胞中有極少數細胞核在進行有絲分裂

的過程中，能發生體細胞染色體間的交換、分離（單倍體化）而產生具有新性狀的單倍體雜合子。

單倍體化：

在一系列有絲分裂過程中一再發生的個別染色體減半，直至最后形成單倍體的過程。

68微生物遺傳變異和菌種保藏（三）酵母菌的接合型遺傳§酵母菌以單倍體或二倍體的狀態存在。§單倍體：a細胞或α細胞，或稱a接合型，α接合型。§二倍體：a細胞和α細胞融合形成二倍體細胞。§接合型遺傳：a細胞α細胞的轉變。盒式機制轉變。69微生物遺傳變異和菌種保藏啟動子沉默狀態沉默狀態a基因表達。a型細胞。盒式機制轉變在于MAT活性區的調控作用70微生物遺傳變異和菌種保藏第四節微生物育種一誘變育種營養缺陷型的篩選三原生質體融合71微生物遺傳變異和菌種保藏一誘變育種1、概念2、誘變劑3.誘變程序4、誘變的主要環節72微生物遺傳變異和菌種保藏1、概念誘變育種是用物理或化學的誘變劑使誘變對象內的遺傳物質（DNA）的分子結構發生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。73微生物遺傳變異和菌種保藏2誘變劑（1）概念：凡能提高基因突變頻率的理化因素。

（2）種類：

1）物理因子（phisicalagents)

物理誘變劑：U.V、χ、γ、快中子、超聲波等。2）化學因子(chemicalagents)74微生物遺傳變異和菌種保藏化學誘變劑

堿基修飾劑

如：羥胺、氮芥、硫酸二乙酯（DES）、亞硝基胍（NTG）

機制：對堿基做修飾，改變堿基的配對性質。堿基類似物

如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）、5-溴尿嘧啶（5-UB）、2-氨基嘌呤（2AP）等。

機制：在DNA復制時將堿基類似物插入DNA中，而堿基類似物存在正常狀態和稀有狀態的轉變，在DNA復制時出現突變體。75微生物遺傳變異和菌種保藏插入劑

(intercalatingagents):

如：溴化乙錠、吖啶橙等一些三環分子。機制：在形態上類似于堿基對的扁平分子。它們插入DNA分子的堿基對之間，使其分開，導致DNA在復制過程中的滑動，引起移碼突變。

76微生物遺傳變異和菌種保藏與胞嘧啶反應，加上羥基（-OH），對胞嘧啶加以修飾。修飾后的胞嘧啶類似胸腺嘧啶T。C—G羥基化的胞嘧啶—A誘發CG到TA的轉換突變堿基修飾劑----羥胺77微生物遺傳變異和菌種保藏堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）正常狀態：類似胸腺嘧啶，與腺嘌呤配對。

A—5BUA—T下一輪復制稀有狀態：類似胞嘧啶，只與鳥嘌呤配對。

G—5BUG—C下一輪復制正常狀態和稀有狀態可以相互轉換78微生物遺傳變異和菌種保藏BDNA分子吸收稀有狀態的5BU

G—5BUA—TDNA復制轉換成正常狀態（G—C）（取代G—C）ADNA分子吸收正常狀態的5BU

A—5BUG—CDNA復制轉換成稀有狀態（A—T）（取代A—T）堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）79微生物遺傳變異和菌種保藏圖示80微生物遺傳變異和菌種保藏3誘變程序

原始菌種原菌種特性鑒定純化斜面/肉湯培養單孢子/單細胞懸液誘變劑處理計算存活率平板分離觀察形態變異，挑單菌落移至斜面初篩復篩小試良種保藏中試81微生物遺傳變異和菌種保藏4誘變的主要環節（1）誘變劑的選擇（2）出發菌株的選擇（3）單孢子或單細胞懸液的制備（4）設計和采用效率高的篩選方案和方法

82微生物遺傳變異和菌種保藏（1）誘變劑的選擇：

1）了解誘變劑的性質、作用機理和使用方法。2）處理方式§單一因子處理：先后使用。§復合因子處理：兩種以上因素同時使用、單一因子重復使用。3）處理劑量：測致死率。方法：平板菌落計數法一般殺菌率為70%左右。

83微生物遺傳變異和菌種保藏（2）出發菌株：

育種的原始菌種應具備：

§對誘變劑的敏感性高；

§生產中選育過的自發變異菌株；

§本身具有一些有利性狀；

§對代謝產物有一定積累；

§已經發生過某些變異。84微生物遺傳變異和菌種保藏（3）單孢子或單細胞懸液的制備

1）必要性：單細胞可均勻地接觸誘變劑，避免出現不純的菌落——菌種退化。

2）制備：物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學誘變劑——緩沖液。3）方法：三角瓶內加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑，用無菌脫脂棉過濾）。4）濃度：細菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml

85微生物遺傳變異和菌種保藏（4）設計和采用效率高的篩選方案和方法

1）初篩：平板上做定性、半定量的測定，觀察突變株的生理效應范圍。

方法

§梯度平板法（抗性菌株）

§紙片法（抗性菌株）

§透明圈法（淀粉酶產生菌株等）

§變色圈法（氨基酸生產菌株）2）復篩：

較精確的生物化學分析方法—做搖瓶測定86微生物遺傳變異和菌種保藏二營養缺陷型的篩選（一）概念（二）篩選方法（三）應用87微生物遺傳變異和菌種保藏（一）概念1.三種遺傳型個體2、篩選用的培養基88微生物遺傳變異和菌種保藏1三種遺傳型個體（1）營養缺陷型（auxotroph）：

經誘變產生的一些合成能力出現缺陷，而必須在培養基內加入相應有機養分才能正常生長的變異菌株。如：Lys-;Bio-（2）野生型(wildtype)：

自然界分離到的任何微生物，在其發生營養缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。如：Lys+；Bio+（3）原養型(prototroph)：

指auxo突變菌株回復突變或重組后產生的菌株，與野生型的表型相同。89微生物遺傳變異和菌種保藏2篩選用的培養基1）基本培養基（minimalmedium,MM）[-]：

僅能滿足野生型菌株營養要求的培養基。2）完全培養基（completemedium,CM）[+]：

滿足一切auxotroph生長的天然或半組合培養基。3）補充培養基（supplementedmedium,SM）[x]：

在MM中有針對性地加入一或幾種營養成分以滿足相應auxotroph生長的組合培養基。90微生物遺傳變異和菌種保藏（二）篩選方法auxotroph的篩選程序：篩選一般要經過誘變、淘汰野生型、檢出和鑒定營養缺陷型四個環節。

細菌培養離心洗滌誘變處理在CM上培養洗滌

MM培養（加青霉素等篩選劑）涂布于CM平板影印培養挑取鑒定菌種保存。91微生物遺傳變異和菌種保藏完全培養基基本培養基完全培養基92微生物遺傳變異和菌種保藏（三）auxotroph的應用（1）作為標記菌株：研究代謝、菌種雜交、重組育種和利用基因工程進行育種時帶有特定基因標記的親本菌。（2）作為生產菌種：氨基酸、核苷酸等生產菌種；（3）作為氨基酸、維生素、堿基等物質生物測定的實驗菌種。93微生物遺傳變異和菌種保藏三原生質體融合（protoplastfusion）§使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發生融合，并發生遺傳重組以產生融合子（fusant）的過程。§已成功地應用于真菌細胞和植物細胞的屬間和科間的遠緣細胞融合，融合產物含兩親代細胞基因組。94微生物遺傳變異和菌種保藏1原生質體的制備2原生質體融合和再生3融合子的選擇95微生物遺傳變異和菌種保藏1原生質體的制備1）選擇兩個親本菌株。

細菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蝸牛酶。2）酶處理破壞細胞壁，使原生質流出。制備用培養基：高滲緩沖液或培養基。96微生物遺傳變異和菌種保藏2原生質體融合和再生1）原生質體融合

化學因子誘導：聚乙二醇（polyethyeneglycol，PEG）

并加入Ca2+、Mg2+等陽離子電場誘導：電極極化原生質體成偶極子，沿電力線排列成串，電流脈沖，原生質體膜被擊穿，融合。2）原生質體再生

在再生培養基上再生。再生率0.幾%~幾%.97微生物遺傳變異和菌種保藏3融合子的選擇營養缺陷型標記選擇依靠在選擇培養基上的遺傳標記，有兩個遺傳標記互補，可確定為融合子。抗藥性標記。98微生物遺傳變異和菌種保藏一、菌種的衰退和復壯（一）衰退（二）防止衰退的方法（三）菌種的復壯100微生物遺傳變異和菌種保藏（一）衰退1、概念：菌種經長期的人工培養或保藏,在其自發突變的影響下，引起某些優良性狀變弱或消失的現象，稱為衰退。2、現象

（1）菌落和細胞形態的改變；（2）生長速度緩慢，產孢子越來越少；（3）代謝產物生產能力或其對宿主寄生能力下降；（4）抵抗力、抗不良環境能力減弱等。101微生物遺傳變異和菌種保藏基因負突變——不利突變

（1）多次傳代造成負突變數量增加

如斜面保藏——

細菌：1個月酵母菌：3個月放線菌、霉菌、芽孢：半年

（2）培養條件；

（3）誘變時出現不純菌落。3、衰退的原因102微生物遺傳變異和菌種保藏（二）防止衰退的方法1、控制傳代次數；2、選擇合適的培養條件；3、采用不同類型的細胞進行傳代；4、采用有效的菌種保藏方法。103微生物遺傳變異和菌種保藏（三）菌種的復壯1復壯：使衰退的菌種恢復原來優良性狀的方法。2復壯的方法：

（1）純種分離：菌落純（劃線法、涂布法、傾注法）菌株純（單細胞挑取法）（2）通過寄主體進行復壯；（3）淘汰已衰退的個體。104微生物遺傳變異和菌種保藏二、菌種保藏（一）目的（二）原理（三）方法105微生物遺傳變異和菌種保藏（一）目的1、存活，不丟失，不污染2、防止優良性狀喪失3、隨時為生產、科研提供優良菌種創造一定條件，盡可能降低微生物代謝活動強度，使之基本上處于休眠狀態。

條件：

1）挑選優良純種的休眠體；

2）創造適合長期休眠的環境條件（干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養、添加保護劑等）（二）原理106微生物遺傳變異和菌種保藏（三）方法1、暫時保藏法——斜面保藏2、長期保藏法107微生物遺傳變異和菌種保藏1、暫時保藏法——斜面保藏（1）方法：斜面置4℃冰箱保藏，定時傳代。