微生物細胞破碎ppt課件41、實際上，我們想要的不是針對犯罪的法律，而是針對瘋狂的法律。——馬克·吐溫42、法律的力量應(yīng)當跟隨著公民，就像影子跟隨著身體一樣。——貝卡利亞43、法律和制度必須跟上人類思想進步。——杰弗遜44、人類受制于法律，法律受制于情理。——托·富勒45、法律的制定是為了保證每一個人自由發(fā)揮自己的才能，而不是為了束縛他的才能。——羅伯斯庇爾微生物細胞破碎ppt課件微生物細胞破碎ppt課件41、實際上，我們想要的不是針對犯罪的法律，而是針對瘋狂的法律。——馬克·吐溫42、法律的力量應(yīng)當跟隨著公民，就像影子跟隨著身體一樣。——貝卡利亞43、法律和制度必須跟上人類思想進步。——杰弗遜44、人類受制于法律，法律受制于情理。——托·富勒45、法律的制定是為了保證每一個人自由發(fā)揮自己的才能，而不是為了束縛他的才能。——羅伯斯庇爾微生物細胞破碎表1胞內(nèi)酶舉例細胞破碎的必要性

圖1革蘭氏菌細胞壁結(jié)構(gòu)圖（a）革蘭氏陽性菌（b）革蘭氏陰性菌圖2酵母細胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖微生物細胞壁的形狀、強度取決于細胞壁的組成以及它們之間相互關(guān)聯(lián)的程度。內(nèi)因：連接細胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價鍵。外因：各類微生物的遺傳信息、培養(yǎng)條件、菌齡、外界環(huán)境等。破碎程度的評價破碎程度常用細胞破碎率（%）表示。破碎率定義為被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：Y（%）=[（N0-N）/N0]*100其中N0——原始細胞數(shù)量；N——經(jīng)t時間操作后保留下來的未損害完整細胞數(shù)量。N0和N的確定方法：直接計數(shù)法：通過平板計數(shù)技術(shù)或血球細胞器上用顯微鏡觀察，直接對適當稀釋后的樣品進行計數(shù)。間接計數(shù)法：在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。細胞破碎技術(shù)其他新的細胞破碎方法：激光破碎法冷凍-噴射法高速相向流撞擊法細胞聲波攪拌液壓冷凍壓力動物細胞7777革蘭氏陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭氏陽性芽孢桿菌5(4)54酵母3.5342.5革蘭氏陽性球菌3.5(2)32.5孢子2(1)21菌絲16(1)5表3細胞對破碎的敏感度注：上述數(shù)字表示相對敏感度，括號則表示數(shù)字不確切。常用的破壁方法珠磨法高壓勻漿法超聲波破碎法X-press法機械法非機械法酶溶法化學滲透法滲透壓法凍結(jié)融化法干燥法常用的破壁方法——珠磨法作用機理：固體剪切作用圖3水平攪拌式珠麿機結(jié)構(gòu)示意圖1—細胞懸浮液2—細胞勻漿液3—珠液分離器4—冷卻液出口5—攪拌電機6—冷卻液進口7—攪拌槳8——玻璃珠

破碎作用遵循一級動力學定律：

破碎的速率和效率是所有操作參數(shù)的函數(shù)，如：珠體的大小、珠體的裝量、細胞濃度、操作溫度、料液性質(zhì)、攪拌器轉(zhuǎn)速與構(gòu)型等。此外，與攪拌器的設(shè)計和研磨腔的結(jié)構(gòu)也有關(guān)系，如轉(zhuǎn)盤外緣速度等。一般來說，磨珠越小，細胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并難以保留在研磨機的腔體中。通常實驗室規(guī)模，珠體直徑為0.2mm較好，工業(yè)規(guī)模不得小于0.4mm。不同的細胞類別及所需提取的酶在細胞中的位置等也是應(yīng)考慮的因素。有研究表明，減小磨珠直徑起先會提高卡樂酵母蛋白質(zhì)的釋放速度，但磨珠再小一些，蛋白質(zhì)的釋放速度反而稍有下降。eg.從酵母細胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶時，則最好使用較大尺寸（如1mm直徑）磨珠。在一定范圍內(nèi)，增加珠體裝填量可以提高細胞破碎率。但超過某一限度時，反不利于細胞破碎和蛋白質(zhì)的釋放。為消除這種影響，必須提高攪拌器的功率，這樣又會增大釋放的熱量，給破碎帶來困難。一般研磨機腔體內(nèi)的填充密度控制在80%-90%，并隨珠體大小變化。細胞濃度對懸浮液的流變特性具有影響，最佳的細胞濃度應(yīng)用實驗來確定。一般用NetzschLM20研磨機破碎時，細胞濃度控制在40%左右。Currie等人的研究表明，操作溫度控制在5-400C范圍內(nèi)對破碎物的影響較小。常采用冷卻夾套和攪拌軸的方式來調(diào)節(jié)磨室的溫度。作用機理：液體剪切作用常用的破壁方法——高壓勻漿圖5高壓勻漿機裝置圖此方法中影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器的次數(shù)。有研究表明，當懸浮液中酵母濃度在450-750kg/m3時，溫度由500C提高到300C，破碎率約提高1.5倍。

圖7細胞濃度及壓力大小對破碎率的影響勻漿次數(shù)圖8勻漿次數(shù)對破碎效果的影響常用的破壁方法——超聲波破碎作用機理：空化現(xiàn)象由無數(shù)細小的空化氣泡破裂而產(chǎn)生的沖擊波的現(xiàn)象。超聲波振動在液體中傳播的音波壓強達到1atm時，功率密度為0.35w/cm2，這時超聲波的音波壓強峰值可達真空或負壓，但實際上無負壓存在，因此在液體中產(chǎn)生一個很大的力，將液體分子拉裂成空洞一空化核。此空洞非常接近真空，在超聲波壓強反向達到最大時破裂。

圖10USB600型微電腦控制超聲波細胞粉碎機圖9超聲波細胞破碎儀的結(jié)構(gòu)示意圖振幅細胞懸浮液的黏度表面張力被處理懸浮液的體積珠粒的體積和直徑探頭的形狀和材料細胞懸浮液的流速影響參數(shù)常用酶：溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等。常用的破壁方法——酶溶法作用機理：

利用酶分解細胞壁上特殊的化學鍵。eg.蝸牛酶——從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種。在某些情況下，不加外源酶也可使某些微生物發(fā)生自溶。

eg.谷氨酸生產(chǎn)菌（如乳糖發(fā)酵短桿菌）加入pH10的緩沖液（0.028mol/LNa2CO3—0.018mol/LNaHCO3），配3%的細胞懸浮液，加熱至700C，保溫攪拌20min，菌體即自溶。

所用的化學試劑：酸、堿、表面活性劑、脂溶性有機溶劑、EDTA鰲合劑、變性劑等。常用的破壁方法——化學滲透法作用機理：改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來。酸、堿：用來調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變細胞所處環(huán)境，改變蛋白質(zhì)的電荷性。有機溶劑：常用的是甲苯，被細胞壁脂質(zhì)層吸收后導(dǎo)致胞壁膨脹，造成細胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。表面活性劑：天然的如膽酸鹽、磷酯，合成的如SDS、Tween、TritonX-100等。變性劑：如鹽酸胍，與水中氫鍵作用，消弱溶質(zhì)分子間的疏水作用。eg.1.某些動物細胞（腫瘤細胞）可采用SDS、去氧膽酸鈉等破壞細胞膜；而細胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果較好。2.用Triton從一種諾卡氏菌中選擇性地提取膽固醇氧化酶。溫和化學滲透劑

溫和化學滲透劑一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量較小的非極性Ｒ基氨基酸。其破碎機理可能是因為小分子的甘氨酸、丙氨酸更易滲透到細胞壁中,通過氫鍵、范德華引力、靜電引力等化學親和力改變細胞壁結(jié)構(gòu),從而改變細胞壁和細胞膜的通透性。細胞類別變性劑清潔劑有機溶劑酶抗生素生物試劑鰲和劑革蘭氏陰性菌******革蘭氏陰性菌***酵母菌******植物細胞****巨噬細胞**表4不同細胞可采用的化學滲透處理方式*表示適用表5機械破碎法與非機械破碎法的比較細胞破壁技術(shù)注意事項多種破碎方法相結(jié)合與下游過程相結(jié)合與上游過程相結(jié)合本章小結(jié)細胞破碎主要方法細胞破碎機理圖思考:1、微生物細胞破碎的原因是什么？有哪些具體的方法？2、G+菌、G—菌以及酵母菌細胞壁的差別在哪里？3、請指出珠磨法與高壓勻漿法各自的原理及適用范圍。4、細胞破壁應(yīng)注意哪些問題？謝謝！21、要知道對好事的稱頌過于夸大，也會招來人們的反感輕蔑和嫉妒。——培根

22、