第六章體外標記免疫分析第1頁，課件共66頁，創作于2023年2月核醫學第六章體外標記免疫分析第2頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記在核醫學中的地位體內診斷：臟器顯像

功能測定診斷

體外診斷：放射分析臨床核醫學治療：131I治療甲亢核醫學實驗核醫學：利用核技術探索生命現象的本質和物質變化規律第3頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析

體外標記免疫分析是一門綜合性學科，也是一門邊緣學科。是集基礎醫學、實驗醫學及臨床應用于一體的學科。在當前的各種免疫診斷技術中，標記免疫分析是最活躍、發展最快的一個領域。第4頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析概念：

是利用放射分析方法或其派生的相關非放射分析技術測定生物樣品中微量生物活性物質含量的一類分析方法。第5頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析特點：

利用抗原－抗體結合反應的特異性，加上各種標記物（標記抗原或抗體）的可測量性來達到方便敏感地檢測各種體內微量生物活性物質，包括內分泌激素、蛋白質、多肽、核酸、神經遞質、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物、血藥濃度等。第6頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析鼻祖:

(Yalow,July19,1921–)

美國科學家Yalow和Berson。于1956年創建的放射免疫分析(RIA)，測定人血漿胰島素獲得成功。樹立了超微量物質體外標記免疫分析的里程碑。1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。第7頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析獲獎:在1977年Yalow和Berson因創建了放射免疫分析，使微量物質的測定成為可能，而榮獲諾貝爾生物醫學獎。第8頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析貢獻:

隨著基礎醫學和相關技術的發展，在RIA標記抗原競爭性抑制結合、IRMA標記抗體非競爭性結合的理論基礎上，相繼派生出許多其它的標記免疫分析方法，如酶標記免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、化學發光免疫分析、電化學發光免疫分析等多種形式、多種反應模式的綜合性標記免疫分析體系，并廣泛應用于基礎醫學、臨床醫學、教學及科研諸多領域，有力地推動了醫學科學的發展。第9頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析

發展:

電化學發光免疫分析化學發光酶免疫分析化學發光標記免疫分析

時間分辨熒光免疫分析酶標記免疫分析

放射受體分析

免疫放射分析

放射免疫分析第10頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析競爭放射結合分析：標記抗原，抗體限量非競爭放射結合分析：標記抗體，抗體過量分類第11頁，課件共66頁，創作于2023年2月第一節體外標記免疫分析的基本原理第12頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析基本原理:非競爭性(標記抗體)IRMA體外標記免疫分析競爭性(標記抗原)RIA第13頁，課件共66頁，創作于2023年2月放射免疫分析（RIA）原理放射免疫技術是標記抗原與未標抗原競爭有限量的抗體，然后通過測定標記抗原抗體復合物中放射性強度的改變，測定出未標記抗原量。第14頁，課件共66頁，創作于2023年2月放射免疫分析（RIA）原理

Ag待測抗原+*Ag+Ab*AgAb+*Ag(標記抗原)(特異性抗體)(標記抗原抗體復合物)(游離的標記抗原)

AgAb+Ag

抗原抗體復合物放射免疫分析（RIA）原理標記抗原(*Ag)和非標記原(Ag)與限量抗體(Ab)競爭結合。*Ag和Ag具有相同的與Ab結合的能力第15頁，課件共66頁，創作于2023年2月RIA(競爭結合反應)原理示意圖AgAg*AbCFAg*BFB/F１.*Ag:定量、足量２.Ab:限量、特異３.*Ag和Ag具有相同的免疫活性４.Ag+*Ag>Ab的有效結合位點５.*Ag和Ag通過競爭的方式與Ab結合，隨著Ag增加，*Ag與Ab結合形成的*AgAb復合物的量減少第16頁，課件共66頁，創作于2023年2月放射免疫分析（RIA）實驗操作步驟：加樣（Ag，*Ag，Ab)→混勻，溫育（反應達到平衡）→分離→測量→數據處理，質量控制第17頁，課件共66頁，創作于2023年2月測量測量復合物計數示意圖：

光子(射線能)與閃爍體的作用↓閃爍體(光脈沖、光能)↓光電倍增管(電能)↓前置放大器(電脈沖)↓電子探測儀

（計數單位是探測器輸出的電脈沖數，CPM或CPS）第18頁，課件共66頁，創作于2023年2月第19頁，課件共66頁，創作于2023年2月RIA(競爭性結合)標準品劑量反應曲線依所測得的復合物的放射性計數(CPM)，對比標準品劑量反應曲線，求知待測品的含量第20頁，課件共66頁，創作于2023年2月免疫放射分析(IRMA)原理單位點：

Ag+*Ab(Ag-*Ab)+*Ab抗原（待測）標記抗體抗原標記抗體復合物雙位點：Ad-Ag+*AbAd-Ag-*Ab

固體抗體-抗原（待測）標記抗體固體抗體-抗原-標記抗體復合物第21頁，課件共66頁，創作于2023年2月IRMA(非竟爭結合)反應原理第22頁，課件共66頁，創作于2023年2月IRMA(非竟爭結合)劑量反應曲線第23頁，課件共66頁，創作于2023年2月RIA＆IRMA的區別方法RIAIRMA1.標記*Ag*Ab2.免疫反應式Ag+*Ag+Ab

*Ag-Ab+AgAg+*AbAg-*Ab+*Ab3.Ab限量過量4.競爭競爭非競爭5.測量復合物*Ag-AbAg-*Ab6.測量物計數值與標本含量呈反比呈正比7.標準曲線形態╲╱8.靈敏度較低高9.測量范圍較窄較寬第24頁，課件共66頁，創作于2023年2月第二節體外標記免疫分析的基本試劑和基本技術第25頁，課件共66頁，創作于2023年2月基本試劑和基本技術１.標準品、質控品２.特異性抗體３.示蹤劑(標記品)４.分離技術第26頁，課件共66頁，創作于2023年2月１.標準品(1)化學結構:應與待測物具有相同的化學結構(2)化學純度：高度純化(3)化學度量：準確(4)穩定性：不易變質、不易降解第27頁，課件共66頁，創作于2023年2月２.特異性抗體(1)親和力大(2)高滴度(3)特異性強(4)可長期保存第28頁，課件共66頁，創作于2023年2月３.示蹤劑（標記品）

（1）高比活度（2）生物活性與免疫活性與標記前一致（3）化學純度>95%（4）穩定性好：標記品不易脫落第29頁，課件共66頁，創作于2023年2月４.分離技術---要求(1)結合部分與游離部分盡可能完全分開(2)非特異性結合率（NSB%）低，小于5%(3)分離的成分便于測量(4)分離效果不受外界環境影響(5)分離試劑操作簡便、價廉易得第30頁，課件共66頁，創作于2023年2月微孔濾膜法鹽析法活性炭吸附法磁化顆粒法雙抗體法固相分離法分離方法第31頁，課件共66頁，創作于2023年2月第32頁，課件共66頁，創作于2023年2月第33頁，課件共66頁，創作于2023年2月第34頁，課件共66頁，創作于2023年2月第35頁，課件共66頁，創作于2023年2月第36頁，課件共66頁，創作于2023年2月第37頁，課件共66頁，創作于2023年2月

第三節體外標記免疫分析的類型第38頁，課件共66頁，創作于2023年2月體外標記免疫分析的類型體外標記免疫分析放射性核素標記免疫分析(RIA、IRMA)酶標記免疫分析發光標記免疫分析(化學發光標記免疫分析化學發光酶免疫分析電化學發光免疫分析)時間分辯熒光免疫分析第39頁，課件共66頁，創作于2023年2月放射性核素標記免疫分析概念：一種將放射性核素測量的高靈敏性、高精確性和抗原抗體反應的高特異性相結合的體外測定超微量（10-9～10-15g）物質的新技術。第40頁，課件共66頁，創作于2023年2月放射性核素標記免疫分析分類:競爭性(標記抗原,抗體限量)RIA非競爭性(標記抗體,抗體過量)IRMA放射性核素標記第41頁，課件共66頁，創作于2023年2月放射性核素標記免疫分析

優缺點：

自1959年Yalow和Berson創建的放射免疫分析（RIA）具有靈敏度高、特異性強、簡便實用、成本低廉等優點。為生物醫學的微量物質分析開創了新的領域。發展到目前為止由此衍生出了各種各樣的標記免疫分析技術。雖然RIA仍有較廣泛的使用市場和價值，但其方法學上固有的弱點使發展受到一定限制。如必須使用放射性同位素作為標記物，存在人為的因素影響較大、輻射防護及防止污染的問題，試劑盒使用時間短，可測量范圍相對較窄，難以實現操作及測量的自動化等。第42頁，課件共66頁，創作于2023年2月酶標記免疫分析（EIA）概念：是應用酶標記抗體（抗原）與抗原（抗體）產生特異性反應，根據酶對底物的顯色反應而定量分析待測抗原或抗體含量。分類:均相EIA：酶增強免疫分析（EMIT）非均相EIA:酶聯免疫吸附分析法（ELASA）第43頁，課件共66頁，創作于2023年2月時間分辨熒光免疫分析(TrFIA)概念：是應用鑭系元素標記抗原或抗體，利用紫外線或激光使其發射熒光，結合波長和時間兩種分辨技術的微量分析方法。常用鑭系元素：銪、鋱、釤、鏑特點：分析范圍寬靈敏度高專一度高穩定性強1234第44頁，課件共66頁，創作于2023年2月發光標記免疫分析化學發光標記免疫分析（CLIA）電化學發光免疫分析(ECLIA)化學發光酶免疫分析(CLEIA)分類第45頁，課件共66頁，創作于2023年2月化學發光標記免疫分析（CLIA）

化學發光免疫技術：化學發光分析是根據化學反應產生的輻射光的強度來確定物質含量的分析方法。化學發光免疫分析是將化學發光系統與免疫反應相結合，用化學發光相關的物質標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應后，經過分離游離態的化學發光標記物，加入化學發光系統的其它相關物產生化學發光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。第46頁，課件共66頁，創作于2023年2月發光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶吖啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）第47頁，課件共66頁，創作于2023年2月化學發光標記免疫分析（CLIA）概念：利用化學反應中釋放大量自由能產生激發態中間體，當其退激到基態時，發射出光子，對這些光子量進行測量從而進行定量分析抗原含量。常用發光劑：魯米諾類、吖啶酯類特點：靈敏度高特異性強重復性好測定范圍寬1234第48頁，課件共66頁，創作于2023年2月化學發光酶免疫分析(CLEIA)是將高特異性的酶標記免疫分析技術和具有高靈敏度的化學發光分析技術相結合的一種標記免疫分析方法。發光劑：金剛烷特點：標記結合穩定發光持續時間長有利于測定123第49頁，課件共66頁，創作于2023年2月辣根過氧化物酶標記化學發光免疫分析示意圖

第50頁，課件共66頁，創作于2023年2月電化學發光免疫分析(ECLIA)簡介：是新一代標記免疫分析技術，與其它標記發光免疫分析的原理不同，是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，采用更為理想的標記物，使用磁性分離及電激發等新技術，進一步推動了發光免疫分析的發展，是目前最先進的化學發光免疫測定系統。第51頁，課件共66頁，創作于2023年2月電化學發光免疫分析(ECLIA)原理：以電化學發光劑三聯吡啶釕標記抗體（抗原），與待測標本中抗原（抗體）產生免疫反應形成復合物以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉移而發生特異性化學發光反應，它包括電化學發光和化學發光反應兩個過程。

特點準確性好多元檢測均相測量穩定性好靈敏度高第52頁，課件共66頁，創作于2023年2月

在電化學發光免疫分析系統中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯吡啶釕標記抗原(抗體)，在反應體系內待測標本與相應的抗體(抗原)發生免疫反應后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯吡啶釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，同時引人TPA緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發光反應，使三聯吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光，光的強度與待測抗原的濃度成正比。第53頁，課件共66頁，創作于2023年2月

[Ru(bpy)3]2+為標記物三聯吡啶釕為水溶性、高穩定性的小分子，可以確保電化學發光的高穩定性，并且無噪音干擾。三聯吡啶釕結構簡單,分子量小，所以，易于標記到任何物質（如抗原、抗體、核酸，等）上，并且對原物質的生物活性及免疫活性影響小。TPA是ECL中的電子供體，氧化后生成的中間產物是形成激發態[Ru(bpy)3]2+化學能來源。電化學發光免疫分析(ECLIA)的標記物第54頁，課件共66頁，創作于2023年2月電化學發光免疫(ECLIA)反應模式圖第55頁，課件共66頁，創作于2023年2月電化學發光免疫分析測定示意圖第56頁，課件共66頁，創作于2023年2月第四節體外標記免疫分析的質量控制第57頁，課件共66頁，創作于2023年2月質量控制的目的近期目的：

通過對測定結果的分析，對本次測定的質量作出評價，并按照預定的要求決定結果的取舍。遠期目的：

通過對不同批測定結果的比較，發現造成成誤差的原因，從而改進實驗條件或設計，以提高質量。第58頁，課件共66頁，創作于2023年2月分析誤差