沙苑子黃酮對MCF【摘要】目的研究沙苑子總黃酮(FAC)對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用以及其對NF-кB表達作用影響。方法以不同濃度(，，，5mg/ml)處理MCF-7細胞6，12，24，48，72h后，SRB法測定細胞增殖抑制；FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法檢測凋亡率變化；用Westernblot法檢測NF-кB蛋白表達。結(jié)果SRB法顯示，，mg/ml濃度沙苑子黃酮作用24，4872h以及mg/ml作用48，72h后MCF-7細胞增殖抑制作用與對照組相比差異具有顯著性；5mg/ml作用48，72h后以及mg/ml作用24h后對MCF-7的增殖抑制作用與對照組相比也有差異性。FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法FCM檢測顯示，不同濃度沙苑子黃酮(，，，5mg/ml)作用72h后，MCF-7細胞早期凋亡率分別為%，%，%，%,晚期凋亡率分別為%，%，%，%。與對照組比較，，mg/ml組早、晚期凋亡率差異具有顯著性，5mg/ml組的早、晚期凋亡率也有差異性，mg/ml劑量組的早、晚期凋亡率與5-Fu組比較差異無顯著性。Westernblot檢測NF-κB表達，再用BandLeader分析。結(jié)果，，/ml濃度組與對照組相比NF-кB表達減少差異具有顯著性；5mg/ml組與對照組相比NF-кB表達也有差異性。結(jié)論沙苑子黃酮對MCF-7具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用；其作用可能與其下調(diào)NF-кB表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】沙苑子總黃酮；MCF-7；NF-кB；5-Fu；凋亡

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，初氏［1］與石氏［2］對北京西城區(qū)近四年的居民疾病死因分析顯示，居民死亡的第1位原因是惡性腫瘤，而乳腺癌居女性惡性腫瘤死亡原因的第3位。上海地區(qū)2002～2005年乳腺腫瘤是第1位死因。乳腺癌與其他惡性腫瘤一樣，藥物治療不良反應(yīng)比較嚴重，甚至有些癌癥病人最后死于藥物的不良反應(yīng)而不是疾病本身。因此，尋找一種對乳腺癌有效，而不良反應(yīng)比較小的藥物是十分有意義的。中醫(yī)中藥是世界醫(yī)藥寶庫中的瑰寶，有很多值得我們探討研究，也是藥物開發(fā)的不竭的寶庫。前期研究顯示，沙苑子黃酮對S180荷瘤小鼠以及H22荷瘤小鼠的腫瘤均有增殖抑制作用［3，4］。本文用SRB法研究MCF-7對沙苑子黃酮的敏感性；FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法FCM法研究沙苑子黃酮對MCF-7誘導(dǎo)凋亡作用；用Westernblot法檢測NF-kB的表達，探討沙苑子黃酮對人乳腺癌細胞株的作用，以期能為乳腺癌的治療開辟一條新的途徑。

1材料與儀器

藥物沙苑總黃酮由蘇州中藥研究所顧振綸教授提供,比色法檢測質(zhì)量分數(shù)為80%。RPMI1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品；超級新生小牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所生產(chǎn)。PMI1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為以mg/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞株人乳腺癌細胞株MCF-7，購于中科院上海細胞生物研究所(中國上海)。

其它試劑FITC-AnnexinⅤ/PI雙染試劑盒(Medsystems,Austria)；兔抗NF-κBp65多克隆抗體、批號為J119，購自SantaCruz公司；Biotinylated兔抗羊IgG自北京中山生購物技術(shù)有限公司；胰酶，AMRESO產(chǎn)品；胰島素，上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；SRB,上海化學(xué)試制公司進口分裝、L-谷氨酸、碘化丙啶，Sigma產(chǎn)品；十二烷基磺酸鈉，上?；瘜W(xué)試劑廠生產(chǎn)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器

CO2孵箱，Napco5410型，美國Napco公司；倒置顯微鏡，XD-20型，重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫檢測儀，DG3002型，國營華東電子管廠產(chǎn)品；流式細胞儀；電熱恒溫水浴鍋，型，上海醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；光柵分光光度計，722型，江蘇科達智能儀器廠產(chǎn)品。

2方法

細胞培養(yǎng)用含10%FBS、200U/L胰島素的MEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，3d傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。以1×106/ml的細胞濃度，分別接種于含F(xiàn)AC濃度為，，，5mg/ml的RPMI1640培養(yǎng)體系中,置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24h后收集細胞，以1×PBS洗滌2次并重懸細胞,備用。

SRB法測定細胞活力［5，6］取生長期MCF-7細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞濃度為4×105/孔,次日進行分組。實驗組分為不同濃度FAC，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)液,陽性對照組加5-Fu，每組均設(shè)4個平行孔。分別置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)培養(yǎng)，分別于6，12，24，48，72h后每孔加入預(yù)冷的80%三氯醋酸50μl使TCA終濃度為10%，固定h,加TCA時必須輕輕地加在培養(yǎng)液的表面，靜置5min后再將平板移至4℃放置1h，倒掉固定液，去離子水洗5遍后,晾干；每孔加入100μl的SRB，室溫放置15min，1%醋酸洗5次,晾干；加入10mmol/LTris液150μl，振蕩2min以溶解SRB。用酶標儀在波長531nm處測定A值。計算腫瘤細胞增殖抑制率(IR)。

增殖抑制率=［/A對照組］×100%

雙染法流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞率［7］采用FITC-AnnexinV/PI雙染法FCM檢測MCF-7細胞凋亡:4℃，1×PBS洗滌細胞2次，調(diào)整細胞濃度至5×105/ml，每100μl細胞懸液加入FITC-AnnexinV5μl和PI染液μl，輕輕混勻，避光置冰上反應(yīng)10min，入400μl1×PBS，混勻，備用。

用Westernblot法檢測NF-кB蛋白表達并進行定量分析［8］MCF-7細胞經(jīng)不同濃度沙苑子黃酮分別處理24，36，48，72h后，用傳統(tǒng)Westernblotting方法［7］檢測NF-кB表達，并用BandLeader分析所得的結(jié)果。

數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以±s表示，采用軟件進行單因子方差分析處理，組間采用Dunnett方法比較。

3結(jié)果

抑制MCF-7細胞增殖SRB法顯示，，，，5mg/ml濃度的沙苑子黃酮作用后，，mg/ml濃度沙苑子黃酮作用24，48，72h以及mg/ml作用48，72h后MCF-7細胞增殖抑制率與對照組相比差異具有顯著性；5mg/ml作用48，72h后以及mg/ml作用24h后對MCF-7的增殖抑制作用與對照組相比也有差異性。結(jié)果見表1及1。表1不同劑量的FAC作用于MCF-7不同時間后對細胞的增殖作用的影響(略)

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法FCM檢測顯示,不同濃度的FAC誘導(dǎo)MCF-7細胞發(fā)生凋亡,在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性,隨藥物濃度的增加,細胞凋亡率增加。FITC-AnnexinⅤ+/PI-細胞為正?；盍毎?FITC-AnnexinⅤ+/PI-細胞為早期凋亡細胞,FITC-AnnexinⅤ-/PI-細胞為晚期凋亡和死亡細胞。，，，mg/ml沙苑子黃酮作用MCF-7細胞72h后細胞早期凋亡率分別為%，%，%，%，晚期凋亡率分別為%，%，%，%。，，mg/ml各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義()；5mg/ml組作用72h后對MCF-7的誘導(dǎo)凋亡率與對照組比較也有差異性()。結(jié)果見圖2。

與對照組比較,**，差異具有顯著性；

與對照組比較，*,具有差異性

Westernblot研究結(jié)果提示NF-κB表達減弱MCF-7細胞經(jīng)不同濃度沙苑子黃酮分別處理24，36，48，72h后NF-κB蛋白的表達量呈下降趨勢，而且這種下降趨勢與作用時間以及藥物濃度成依賴關(guān)系。結(jié)果見圖3。根據(jù)前面的實驗選取作用比較強的時間點72h作為作用點，以不同濃度沙苑子黃酮分別作用MCF-7，72h后用Westernblot法檢測NF-κB表達情況。再用BandLeader軟件分析，結(jié)果顯示，5，，，mg/ml濃度組與對照組相比NF-кB表達減少差異具有顯著性，5mg/ml組與對照組相比NF-кB表達也有差異性。見圖4。

4討論

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪Astragaluscomplanatus干燥成熟的種子，性溫味甘，歸肝、腎，始見于《臨證指南醫(yī)案》,曾以白蒺藜、沙苑蒺藜、沙苑白蒺藜、潼蒺藜等名稱收入歷代諸家本草。沙苑子具有溫補肝腎，固精，縮尿，益肝明目的功能。自20世紀80年代開始,有不少藥學(xué)者對沙苑子進行了較為集中的研究，并發(fā)現(xiàn)其對循環(huán)系統(tǒng)、肝、腎、免疫系統(tǒng)等有一定的藥理作用［9,10］。沙苑總黃酮是沙苑子的乙醇提取物，主要成分是黃酮。先前的藥理研究表明：沙苑子黃酮具有改善血液流變學(xué)指標、抗肝纖維化、誘導(dǎo)白血病細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫功能等作用［2,3］。根據(jù)中醫(yī)理論認為：乳腺癌的發(fā)病與腎虛有一定關(guān)系，而沙苑子黃酮具有益腎的作用。因此，本文推測沙苑子黃酮具有抗乳腺癌的作用，以人乳腺癌細胞株MCF-7作為研究對象，探討沙苑子黃酮對人乳腺癌的作用及其機制。

近年來研究表明［11～13］,核轉(zhuǎn)錄因子кB(nuclearfactor-кB,NF-кB)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子蛋白,對多種基因表達上調(diào)起關(guān)鍵作用，在腫瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。NF-кB有抑制細胞發(fā)生凋亡的作用,而許多抗腫瘤藥的作用機理正是誘導(dǎo)了腫瘤細胞凋亡。沙苑子黃酮作用之前，MCF-7細胞中NF-кB表達呈陽性,主要定位于癌細胞的細胞核中；沙苑子黃酮作用之后，NF-кB陽性的表達顯著降低,主要定位于MCF-7細胞的胞質(zhì)。因此沙苑子黃酮具有抑制NF-кB在MCF-7種表達的作用，因此可以誘導(dǎo)細胞凋亡。

本文首先通過SRB法篩選法，確定對MCF-7增殖抑制作用最佳濃度梯度以及最佳時間點。再用最佳濃度梯度和作用時間點處理MCF-7細胞，檢測細胞凋亡、凋亡相關(guān)基因以及蛋白表達。結(jié)果顯示，沙苑子黃酮對MCF-7具有明顯的增殖抑制作用，最高增殖抑制率達到%。沙苑子黃酮具有顯著的誘導(dǎo)MCF-7凋亡的作用，早期凋亡率達%，晚期凋亡率為%。通過最佳作用濃度沙苑子總黃酮作用有效時間后，NF-κB表達與濃度梯度及作用時間呈負相關(guān)。令人感興趣的是這種基因表達結(jié)果正好與流式細胞分析結(jié)果相吻合，提示沙苑子黃酮作為治療乳腺的藥物之一，值得進一步研究。

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