正交法優化植物生長調節劑在黃芪愈傷組織生長中的應用【摘要】目的研究膜莢黃芪葉愈傷組織誘導、生長及黃芪多糖合成的最佳生長調節劑組合。方法以膜莢黃芪葉為外植體，運用正交設計研究6-BA、2,4-D和NAA等3種植物生長調節劑組合對愈傷組織誘導、培養及黃芪多糖合成的影響。結果分別以誘導率、相對生長速率和黃芪多糖含量為指標，結果表明NAA和6-BA對愈傷組織誘導率影響顯著，6-BA、2,4-D和NAA都對愈傷組織的生長影響顯著，2,4-D和NAA對黃芪多糖合成影響顯著。結論誘導愈傷組織的最佳培養基為：MS+2,4-D+6-BA+NAA；愈傷組織生長的最佳培養基為：MS+2,4-D+6-BA+NAA；促進黃芪多糖合成的最佳培養基為：MS+2,4-D+6-BA+NAA。

【關鍵詞】膜莢黃芪植物生長調節劑愈傷組織正交設計黃芪多糖

Abstract：ObjectiveTostudytheoptimumcombinationsofplantgrowthregulatorsintheinduction,growthandpolysaccharidebiosynthesisofcallusfromtheleavesofAstragalusmembranaceus(Fisch.)theleavesofAstragalusMembranaceus(Fisch.)Bgeasexplants,threekindsofplantgrowthregulators,including6-BA，2,4-DandNAA,wereintroducedintocallusinductionandgrowth,andpolysaccharidebiosynthesisbyorthogonalparameters,includinginductionrate，relativegrowthrateandcontentofAstragaluspolysaccharide,wereusedascriteriaofestimatingtheefficiencyofthreeregulators,bothNAAand6-BAcouldinducecallusmosteffectively,threeof6-BA,2,4-DandNAAallcouldaffectthegrowthofcallusremarkably,andboth2,4-DandNAAcouldpromotethesynthesisofpolysaccharideseffectivelyascomparedwith6-BA.ConclusionTheoptimalculturemediumforcallusinductionis:MS+2,4-D+6-BA+NAA；Theoptimalculturemediumforcallusgrowthis:MS+2,4-D+6-BA+NAA;andtheoptimalculturemediumforthesynthesisofAstragaluspolysaccharidesis:MS+2,4-D+6-BA+NAA.

Keywords：Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.；Plantgrowthregulators；Callus；Orthogonaldesign；Astragaluspolysaccharides

黃芪是豆科黃芪屬植物，全世界約二千多種，而我國分布有278種、2亞種35變種2變型，南北各省區均產［1］。黃芪的根是重要的中草藥，其中膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.和蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao是它的法定基原，為正品。黃芪的藥用成分主要是皂苷類、黃酮類和多糖等，在抗衰老、增強免疫力、強心降壓等方面有重要的作用［2，3］。由于長期大量、無節制采挖和環境的污染，造成野生黃芪資源幾近枯竭［4］；而人工栽培的藥用黃芪，存在著勞動強度大、品質控制困難以及可耕地減少等限制因素。所以，利用生物技術大規模生產黃芪原材料，滿足日益增長的醫藥市場需要，成為解決黃芪資源不足的重要途徑之一。

本文以膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.葉片為外植體，應用正交設計實驗，研究6-BA，NAA和2,4-D對愈傷組織的誘導、生長和黃芪多糖合成的影響，以期篩選適宜的生長調節劑組合。

1材料與方法1材料供試為盆栽膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的幼嫩葉片。2正交實驗設計采用L9(34)正交設計，研究6-BA，NAA和2,4-D等3種植物生長調節劑對愈傷組織誘導和生長以及黃芪多糖合成的影響，因素水平見表1。采用MS基本培養基，其中含30g·L-1的蔗糖和8g·L-1的瓊脂，pH。本文所有正交實驗均用同一實驗設計。實驗結果用正交設計助手II專業版進行極差分析和方差分析。表1因素水平3愈傷組織誘導與培養選取生長良好的黃芪植株，取幼嫩葉片，自來水沖洗干凈，75%酒精消毒30s，%HgCl2消毒7min，然后用無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干水分，切成cm2的小塊，接種在正交設計的9種培養基上培養，每種接5瓶，每瓶接5片。培養條件采用黑暗培養，(24±1)℃。30d后統計誘導率。

挑選生長良好的愈傷組織，稱重后繼代培養。30d后稱重，按下式計算相對生長速率：相對生長速率(Rr)=t-11n其中：W1為接種時愈傷組織鮮重；W2為收獲時愈傷組織鮮重；t為愈傷組織培養時間。以上實驗均重復兩次取平均值。

4多糖含量測定提取［5］將愈傷組織在50℃下烘干至恒重，粉碎，準確稱取g，用濾紙包好置索氏提取器中加入適量70%的乙醇提取3h。濾紙包揮干乙醇，放于小燒杯中加入20倍量的去離子水超聲波提取110min。水提液濃縮定容于25ml的容量瓶中備用。含量測定采用蒽酮比色法，按照文獻［6］中的方法測定黃芪多糖。

2結果

3種植物生長調節劑對愈傷組織誘導率的影響黃芪葉片誘導3d時邊緣開始膨脹，第7天時邊緣處長出愈傷組織。培養到30d時，3號、5號和8號培養基全部誘導出愈傷組織，誘導率為100%。其中3號誘導出的愈傷組織質地疏松，生長較快。結果見表2。表2愈傷組織誘導、生長和多糖含量結果表3極差分析

正交實驗結果表明，不同生長調節劑組合對黃芪愈傷組織誘導的效果差別較大。如表3極差分析結果所示，3種植物生長調節劑對愈傷組織的誘導效果的大小順序是NAA＞6-BA＞2,4-D。對誘導率進行方差分析。結果表明NAA因素影響高度顯著，6-BA因素顯著，而2,4-D因素不顯著。通過誘導率的極差和方差分析，最佳的組合是A1B2C3。通過實驗驗證得知，該組合對愈傷組織的誘導率為100%，并且生長良好。表4方差分析

3種生長調節劑對愈傷組織生長的影響挑選生長良好的愈傷組織繼代培養30d收獲，稱重，計算相對生長速率，結果見表2及極差分析見表3。結果表明，愈傷組織在不同培養基中生長速度不同，生物量有很大的差異，其中組合3為最佳水平組合，相對生長速率達2。表5示相對生長速率方差分析的結果，表明3個因素對愈傷組織生長的影響都顯著，其順序是6-BA2,4-DNAA。表5方差分析(相對生長速率)

3種生長調節劑對黃芪多糖合成的影響由黃芪愈傷組織中的黃芪多糖含量與極差分析可知組合4的樣本中多糖含量最高，為干重的%，但經極差分析可知產黃芪多糖最多的組合應該是A2B2C2組合。它不在本正交設計表內，理論上它應該達到%以上，其真實值有待于進一步驗證。

多糖含量的方差分析結果見表6。由表6可知，2,4-D和NAA對黃芪多糖合成的影響顯著，6-BA的影響不顯著，其影響大小順序為NAA2,4-D6-BA。表6方差分析

3討論

本研究初步篩選出影響黃芪愈傷組織誘導、生長和多糖合成的主要因素，優化出了理論上的最佳植物生長調節劑配方。

植物生長調節劑對植物離體培養具有非常重要的調控作用，選擇合適的生長調節劑種類和濃度是愈傷組織誘導和生長的關鍵因素［7］。本文結果表明NAA與6-BA在誘導愈傷組織的過程中起著決定性的作用，生長素與分裂素配合使用更有利于愈傷組織的誘導，但2,4-D的影響不顯著。張愛娟等［8］在研究內蒙黃芪的組織培養中發現，2,4-D對愈傷組織的誘導效果優于NAA，與本文的結果有差異。本實驗采用的是盆栽膜莢黃芪葉而張愛娟等采用的是內蒙黃芪的無菌苗，兩者的外植體材料不同，再加上她們采用的培養條件與本實驗也不完全相同，這些可能是導致兩者結論差異的原因。另外，本研究發現2,4-D對愈傷組織的誘導影響不顯著，并且2,4-D對人體有毒副作用，所以可以在黃芪愈傷組織培養基中不添加2,4-D，或者添加毒副作用小、生理活性強的替代品［9］。

【參考文獻】

［1］張東佳,楊永建,趙汝能.甘肅黃芪屬藥用植物資源［J］.中國野生植物資源,2005,24(1):38.

［2］吳發寶,陳希元.黃芪藥理作用研究綜述［J］.中藥材,2004,27(3):232.

［3］ShaoBM,XuW,DaistudyontheimmunereceptorsforpolysaccharidesfromtherootsofAstmgalusmembamnaceus,aChinesemedicinalherb［J］.BiochemBiophysResCommun,2004,20(4):1103.

［4］趙明,段金廒,黃文哲,等.中國黃芪屬(AstragalusLinn.)藥用植物資源現狀及分析［J］.中國野生植物資源,2000,19(6):5.

［5］張桂娟,江蔚新,陳明