本研究以多年生釀酒葡萄赤霞珠的幼嫩莖段為外植體，以其培養出的組培苗為材料，通過添加灰葡萄孢誘導子和水楊酸，研究誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇合成及抗氧化酶活性的影響。主要研究結果如下：1.以赤霞珠葡萄新梢的半木質化莖段作為外植體材料，接種培養污染率低，外植體萌芽率高，萌芽率為96.5%；消毒溶液以0.1%升汞溶液消毒8min效果最好。2.繼代培養和生根培養以1/2MS+IBA0.2mg?L-1+蔗糖20g?L-1培養基培養赤霞珠葡萄組培苗生長狀況最好，成苗率為99.67%，生根率為99.67%。3.灰葡萄孢誘導子誘導赤霞珠組培苗，誘導9d的效果最好，可以使處理中白藜蘆醇的含量比對照高近1.67倍；水楊酸誘導赤霞珠組培苗，誘導9d的效果最好，可以使白藜蘆醇含量比對照高1.5倍。4.灰葡萄孢誘導子處理后赤霞珠組培苗中PAL、POD、SOD、CAT、PPO活性均大于對照，分別是對照的2.17、1.58、1.48、1.83、2.11倍。水楊酸處理后赤霞珠組培苗中PAL、POD、SOD、CAT、PPO活性均大于對照，分別是對照的1.37、1.13、1.23、1.03、2.19倍。5.綜合分析得出，灰葡萄孢誘導子對赤霞珠組培苗白藜蘆醇的促進效果比水楊酸好。關鍵詞：赤霞珠，組培苗，白藜蘆醇，抗氧化酶，灰葡萄孢，水楊酸第一章文獻綜述1.1葡萄快速繁殖體系的研究進展葡萄快繁體系的建立，主要應用莖尖、帶芽莖段為材料進行繁殖，為再生體系的建立提供材料(葉片、葉柄和莖段等)，同時用于良種快繁、脫毒、種質交換和保存等方面[2-6]。1.1.1外植體的選擇與處理盡管葡萄是最先進行離體培養的植物之一，但再生快繁技術到二十世紀七十年代才有報道。離體培養是將一小塊植物組織切下來，與原來污染的植物器官分離，建立無菌體系。為了所選的無菌外植體在一開始時可以生存，就必須有非常強的生理適應能力，并漸漸適應。外植體增殖可以由莖段、莖尖以及具有分生能力的碎片組織得到。不同外植體對離體存活和芽分生能力有一定影響，頂端分生組織通常被認為是外植體微繁的最好選擇，然而在葡萄上也有人報道腋芽比頂芽更利于存活與再生[7]。環境因素和母體生理狀態對它有非常大的影響，一般溫室生成的芽比大田苗成活率高，容易萌發的苗是健壯的、營養充足。得到成功無菌體系及降低污染的前提條件是適宜的原材料處理。把幼嫩葡萄帶芽莖段從大田中取回，先用自來水沖洗多次，然后放在超凈工作臺上用70%酒精清洗30秒，用無菌水沖洗3-5次后，再用0.1%的升汞溶液消毒5-6分鐘，接著用無菌水反復沖洗3-5次，然后把下部褐化的傷口切掉，得到長約2cm的莖段，接種到繼代培養基上。接種幾天后，免除產生的許多酚類物質分散在培養基中切除褐化部位，阻止離體繼續生長[8，9,10]。1.1.2培養基和激素的選擇選出最好的培養基是建立良好的葡萄繁殖體系和再生體系的主要工作之一。葡萄離體培養國內外一般使用MS、B5、NN等培養基較多，許多細胞分裂素和生長素，在葡萄快繁研究中基本都有應用[8-13]。第一類：富集元素平衡培養基該類的主要培養基是MS，其特點是：①營養豐富，不需再加入水解蛋白等有機成分；②微量元素種類較全，濃度較高。與MS相類似的培養基或稱從MS改良后的培養基還有LS培養基、BL培養基、BM培養基及ER培養基等。第二類：硝酸鉀含量較高的培養基這類培養基有B5、N6、SH等培養基。這類培養基的特點是：①按態氮的含量低(高銨對有些植物有抑制作用)；②含有較高的鹽酸硫胺素。第三類：中等無機鹽含量的培養基這類培養基有H、Nitsch、Miller和Blaydes培養基。其特點是：①大量元素無機鹽約為MS的二分之一；②微量元素種類減少而含量增高。在植物中，生長素主要影響莖和節間伸長、向性、頂端優勢、葉片脫落和生根等。在組織培養中，促進細胞分裂、誘導愈傷組織和生根等是它的主要功能，其中用于生根的主要有IBA和NAA，并能與細胞分裂素互作促進莖的增殖。細胞分裂素主要促進細胞分裂，改變頂端優勢，促進芽的分化等。激素使用的關鍵是細胞分裂素與生長素的比例，根據培養的目的進行調節，原則是生長素濃度明顯低于細胞分裂素，則促進細胞分化，反之促進細胞脫分化誘導愈傷組織。細胞分裂素與生長素的種類對不同植物的敏感性不同，因此激素種類的選擇應以植物種類而宜。有些植物不能或很難得到芽的分化，這也許是因為沒滿足其分化的條件，如果破例使用一些不常用的激素或激素抑制物，如脫落酸、2，3，5-三碘苯甲酸(0.02mg/L)、7-氮-吲哚硝基苯酰溴(0.01-0.lmg/L)等，就有可能啟動芽的分化。1.1.3增殖1978年BarlasS和Skene報道了葡萄試管苗快繁技術。1979年曹孜義等，在國內首次報道了葡萄試管繁殖技術，并于1980年建立了我國首個植物組織培養的葡萄園。從此關于葡萄莖尖繁殖的研究越來越多[11]。1981一1982年，劉培德等人進行了貴人香、二號白大粒、白羽等24個品種的莖尖再生研究，認為葡萄莖尖再生較易成功，只要是從旺盛生長的新梢上取下莖尖，接種到含有一定濃度的BA和NAA的MS培養基上，就能順利完成莖尖分化、芽叢形成和生根成苗[3]。1985-1986年，晁無疾等通過對先鋒、乍娜、黑奧林、紅富士4個品種帶芽莖段組織培養方法進行研究，取得了較好結果，成苗周期為25天，繁殖倍數為3左右。至今，葡萄莖尖(段)離體培養已作為一項成熟的生物技術被運用到各個品種研究中[4]。影響葡萄試管苗繁殖的因素有[11,14,15]：1.基因型不同種、品種及品系對培養基和培養條件有不同的要求，已被許多研究者所報道。Chee和Pool(1983)用21個基因型進行試驗，除雜種賽維爾這一基因型不能進行試管繁殖外，其余均可進行。其中康可、赤霞珠、玫瑰露等基因型繁殖最快。2.繼代次數在器官發生型和胚狀體發生型試管繁殖中，有隨繼代次數和繼代時間的增加，分化和再生能力、繁殖速度有下降的趨勢，甚至完全喪失。但曹孜義經多年研究認為隨繼代培養時間的延長，葡萄試管苗繁殖速度并未降低。3.培養基成分培養基成分是否適宜，對葡萄繁殖有很大影響。培養基成分包括基本培養基，有機成分和激素。4.培養條件培養條件中光強度、光周期、溫度和容器等對葡萄繁殖速度均有影響。一般用2000Lx一300OLx日光燈，培養溫度為27士2℃。并非所有基因型都能成功，玻璃化，水分缺乏、營養或酚類物質積累等，增殖頻率通常很低最后使有些基因型。1.1.4生根和移栽生根培養基一般含有生長素而沒有細胞分裂素。Barless和Skeen(1978，1990)獲得了培養基能生根在缺少生長素的情況下，然而Chee和Pool報道NAA、IBA、IAA在葡萄生根方面有作用，2，4-D無作用。同時在對一系列基因型葡萄實驗中發現，IBA優于IAA、NAA和2，4-D。合適的生長素濃度是非常重要的，生長素能夠刺激根的發生但也能抑致根的生長[2]。最后是把生根的無菌葡萄組培苗移栽到土壤中生長。齊與樞[11]等1986年提出得到較高的成活率的移栽方法是通過光培煉苗、沙培煉苗、溫室營養袋煉苗、大田苗圃移栽等過程。1.2白藜蘆醇研究進展1.2.1白藜蘆醇的理化性質白藜蘆醇（resveratrol，簡稱Res），是植物體內產生的天然二苯乙烯類多酚物質，具有順式和反式兩種構象，是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物[16-17]，化學名稱為3，4，5-三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3，結構式（如圖1），相對分子質量228.25，為白色針狀晶體，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸、乙酯等有機溶劑，在波長365nm的紫外光照射下能產生熒光，并能和三氯化鐵-鐵氰化鉀起顯色反應[18]。熔點253-255℃，261℃即升華。它是植物在惡劣環境下或遭到病原體侵害時，植物自身分泌的一種可抵御霉菌感染的抗菌素。1.2.2白藜蘆醇的藥理作用白藜蘆醇有許多藥理活性，如抗菌、抗氧化、預防心臟病、抗癌、抗血小板凝聚、保護肝臟、雌激素作用、防輻射、免疫調節、抗艾滋病活性等[19-22]。白藜蘆醇可以抑制多種酶或細胞因子的活性，抑制前列腺素H2合成酶、還氧酶I、蛋白激酶、酪氨酸酶、核糖核苷酸還原酶、腫瘤壞死因子等而起抗腫瘤作用[23-24]、最重要的是白藜蘆醇對人體的正常細胞沒有損害，具有良好的藥理活性和選擇性，很有可能被開發成一種療效高、副作用小的新藥。1.2.3白藜蘆醇在自然界中的分布及應用狀況第一次發現白藜蘆醇是在1939年，第一次發現葡萄中含有這種物質是在20世紀70年代，后來人們發現虎杖、花生、桑椹等植物中也含有這種成分[25-26]。天然白藜蘆醇是一種天然活性成分，它在植物(如中藥材虎杖)中分布及生物合成是以游離態(順式、反式)和糖苷結合態(順式、反式)2種形式，且均具有抗氧化效能，其中順式異構體的生物活性低于反式，是葡萄中的一種重要的植物抗毒素[27-28]。人們廣泛的研究了其自然資源，至少在21個科、31個屬的72種植物中發現了白藜蘆醇[29]，如：葡萄科的葡萄屬、蛇葡萄屬[30]，豆科的落花生屬、決明屬、槐屬，百合科的藜蘆屬，姚金娘科的桉屬，蓼科的蓼屬等[31-33]。許多常見的藥用植物都含白藜蘆醇，有的就是食物，如：葡萄、葡萄皮中白藜蘆醇的含量最高，可達50~100mg/kg。第一次在商業葡萄酒中發現白藜蘆醇是在1992年。國外的大量研究證明，白藜蘆醇是葡萄酒(尤其是紅葡萄酒)中最重要的功效成分。20世紀80年代，世界衛生組織調查發現，盡管法國人偏愛奶酪等高脂肪食物，但冠心病發病率和死亡率比其他西方國家低，這可能是法國人常飲含白藜蘆醇的葡萄酒的緣故。此后，白藜蘆醇備受關注。1.2.4白藜蘆醇在葡萄中的相關研究在葡萄的根、莖、葉、果皮中均含有白藜蘆醇，葡萄白藜蘆醇的含量因葡萄品種及其器官的不同而存在明顯差異。陳雷等[34]通過對葡萄不同組織部位白藜蘆醇含量的研究發現，葡萄不同部位中白藜蘆醇，含量差異很大，大致趨勢為果穗軸、果皮>葉片、種籽、葉柄>葡萄果肉。李婷等研究表明，葡萄中白藜蘆醇含量由高到低的順序為果梗、葉片>果皮>種籽>葉柄。鄧建平等曾報道[35]對13個葡萄品種不同發育時期的莖段、葉片、果皮中白藜蘆醇的含量進行了研究，結果發現不同葡萄品種中白藜蘆醇的含量不同，不同成熟期其葉片、果皮中白藜蘆醇的含量依次為成熟葉＞老葉＞嫩葉，成熟果皮＞嫩果皮；在所有檢測樣品中以刺葡萄的成熟果皮中白藜蘆醇的含量為最高（12.90μg/g）。鄧建平等報道[36]分別以巨峰和紅地球葡萄的果皮、莖、葉為材料，利用不同培養基對其愈傷組織進行誘導，并測定愈傷組織中的白藜蘆醇的含量。其結果表明外植體中白藜蘆醇的含量達0.47~9.62μg/g，愈傷組織中白藜蘆醇的含量分別是其對應的外植體中白藜蘆醇含量的1~1.8倍。隨后，2010年鄧建平等報道[37]以巨峰葡萄果皮為實驗材料，通過優化繼代培養基的研究，發現結果在B5＋5mg/L萘乙酸（NAA）＋0.7mg/L6-芐基嘌呤（6-BA）＋5%蔗糖的培養基上，白藜蘆醇的含量高達464.52μg/g（干質量），與優化前的含量相比提高了2.6倍。由上述研究發現，利用生物技術手段提高葡萄中白藜蘆醇的含量是一種切實可行的方法，而建立合適的細胞懸浮培養優化體系提高白藜蘆醇的產量也將是植物細胞懸浮培養技術在白藜蘆醇生產中的發展趨勢。這些報道為進一步研究提高葡萄中白藜蘆醇含量打下基礎。1.3誘導子對植物次生代謝產物的影響及應用誘導子(elicitors)是植物抗病生理過程中誘發植物產生植物抗毒素和引起植物過敏反應(hypersensitive)或自身防御反應(self-defensereation)的因子[38]，包括侵染植物細胞內的分子及植物的微生物。近年來，越來越多的研究證明誘導子在植物次生代謝的調控及其細胞內信息傳遞等方面具有重要作用。1.3.1誘導子的分類誘導子依據它的來源可分為內源性誘導子和外源性誘導子；根據性質可分為生物誘導子和非生物誘導子兩類，生物誘導子主要是指微生物類誘導子，是指植物在防御過程中，為抵抗微生物侵染而產生的物質，主要包括分生孢子(conidia)、有機體的細胞壁碎片、有機體產生的代謝物、降解細胞壁的酶類以及培養物濾液中的成分，如真菌的菌絲體、菌絲體降解產物、發酵液、真菌分泌物等。非生物誘導子是指不是細胞中天然成分，但又能觸發形成植保素的信號因子，如水楊酸、茉莉酸甲酯、紫外線、高溫、低溫、pH值、乙烯、重金屬鹽和高濃度鹽等[38]。1.3.2誘導子調節植物產生次生代謝產物的機理當前利用誘導子來促進植物次生代謝產物生產的研究雖然已取得了一些進展，但很多不完善的地方還存在著。在誘導物的作用機制方面，人們只是有大概的推測，并沒有很深刻的了解。不過有一個初步的假說得到了大家的認可，這一假說獲得了大量的實驗證明：即作為一種外界信號誘導子被植物細胞膜上的受體所識別，并與之結合，從而引起一系列反應在細胞膜上及細胞內，使與植保素有關的酶合成或活性發生變化，從而引起植物基因表達發生變化，最終導致植保素的合成和積累[39]。誘導子作為外界信號要被細胞識別，起初是通過誘導子與細胞膜上受體的結合來實現的，這一過程會引起膜成分的變化導致引起膜的通透性、膜內離子分布的變化。作為外界信號誘導子作用胞質膜而引起膜上發生變化，到引起胞內基因啟動、酶活性改變的過程應該是一個級聯過程，這中間需要有物質充當胞內信使，也即第二信使，目前人們由實驗推出的主要第二信使包括Ca2+、磷酸肌醇、cAMP、水楊酸、G-蛋白、甲氧基酯及其茉莉酮酸以及植物細胞壁組成成分等。誘導子信號被傳遞到細胞內以后，通過控制次生代謝途徑中關鍵酶的合成來調節次生代謝產物的合成。許多研究表明，植物細胞能識別某些專一的誘導物，而對其它誘導物則沒有反應[40]。Francois[41]報道葡聚糖能被豆類植物所識別在研究的許多植物中；茄科植物馬鈴薯可識別不飽和脂肪酸等[42]。Dixon[43]曾假設細胞識別誘導物后，于細胞內傳遞誘導物信號通過兩條途徑：一是誘導物與受體結合后，引起細胞內吞，從而進入細胞，直接作用于核特異基因。Bolwall等[44]發現，菜豆細胞是以內吞方式吸收誘導物的，而且放射性標記的誘導物從培養液中快速消失，然后分布于菜豆的細胞質和細胞核內。還有待進一步研究的是誘導物進入胞內后怎樣作用于核特異基因來調控植物的次生代謝。二是誘導物與受體結合后，激活膜聯第二信使系統，間接激活核特異基因。在植物細胞中，一些細胞第二信使系統的關鍵組分也存在著，如鈣調素[45]、磷酸肌醇[46]、AMP[47]等，植物細胞通過第二信使對真菌誘導子信號進行級聯放大，轉導到其他的細胞、組織和器官中。誘導物信號使植株產生相應的防衛反應，包括產生酚類物質、活性氧迸發、誘導防衛相關蛋白基因的表達、促進次生代謝產物的合成等[43]。Hahlbrock等[48]對歐芹進行研究時，發現一個來源于病原菌糖蛋白表面的縮氨酸誘導子與歐芹懸浮細胞的原生質膜上的受體結合后，最初的反應是細胞膜兩側的無機離子流瞬間大量地增加并伴有H2O2的生成；隨后，不同的蛋白質磷酸化位點瞬間改變，與防衛反應相關的基因被激活，而-些與防衛反應無關的基因失去活性；有大量不同的順式作用元件和反式調節因子參與了誘導子的基因調節作用，其復雜性與胞內信號轉導情況相似。誘導信號被傳遞到細胞內以后可能誘導新酶的合成，啟動新的代謝支路，從而合成新的次生代謝物。李家儒等[49]在紅豆杉細胞中添加桔青霉誘導子，使苯丙氨酸活性增強，從而促進紫杉醇的合成，并且過氧化物酶、可溶性蛋白質、酯酶同工酶電泳掃描圖譜中出現新的譜帶。李靖等[50]對黃瓜感染霜霉病菌葉片中-些酶活性的變化中發現，有新的酶帶出現在多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)同功酶中。誘導子提高次生代謝物產量，還可以通過刺激或誘導代謝過程中某些關鍵酶量增加。張長平等[51]在南方紅豆杉細胞懸浮培養體系中，加入真菌誘導子-尖孢鐮刀菌胞壁成分的粗提取物，使苯丙烷類代謝途徑中重要的酶PAL的活性顯著升高，紫杉醇的含量得到了大幅度的提高，達到對照組的5倍左右。寧文等[52]在滇紫草細胞培養中加入曲霉菌誘導子，使滇紫草色素含量比對照提高了兩倍。1.3.3誘導子對植物次生代謝合成途徑及細胞生理反應的影響誘導子的誘導作用在植物次生代謝機制方面的研究顯得特別重要是因為很多植物抗毒素是珍貴的天然藥物。這類研究主要涉及苯丙烷類和類異戊二烯生物合成途徑。苯丙烷類生物合成途徑：植物體內次生代謝的一條重要途徑就是苯丙烷類代謝途徑，一切含苯丙烷骨架的物質都是由這一途徑直接或間接生成。苯丙烷類生物合成途徑的關鍵酶有苯丙氨酸裂解酶(PAL)和查爾酮合成酶(CHS)。目前為止，依賴真菌誘導的PAL和CHS基因被克隆已經有很多植物。煙草PAL基因為1個由3-4個不連續基因組成的基因家族編碼。該基因被強烈地誘導表達在真菌誘導子處理后[53]。Pisumsativum基因組中有2個CHS基因串聯排列，中間隔1個88nt的內含子。基因中含CCTACCmotif，該基因能夠被真菌誘導子誘導[54]。豌豆PAL和CSH基因序列都有在TATA近側區的At-rich部分存在，至少有一個細胞核內因子與該部位穩定地結合[55]。在苯丙烷合成途徑中苯丙氨酸裂解酶是第一個酶，它的活化可以啟動苯丙烷途徑。在離體條件下苯丙氨酸裂解酶活性常受特異性抑制，而使各種植物的抗性降低。誘導子處理后苯丙氨酸裂解酶活性升高[56，57]。紫草細胞中萘醌類物質合成的關鍵酶之一是苯丙氨酸裂解酶，劉長軍等[58]報道黑曲霉誘導子處理新疆紫草細胞后，苯丙氨酸裂解酶活性明顯增加，而且與紫草素的積累表現出一定的正相關。類異戊二烯生物合成途徑：存在兩條生物合成途徑在類異戊二烯生物合成途徑中，即甲羥戊酸途徑和丙酮酸/磷酸甘油醛途徑。在甲羥戊酸途徑中，HMGR是甾體代謝中的重要調控點[59，60]。近年來，HMGR是植物甲羥戊酸途徑調控的第一個關鍵酶在許多植物材料次生代謝的研究中證明了[60，61]。Choi[60]等用馬鈴薯塊莖切片觀察新陳代謝，發現受傷或切割塊莖組織會誘導類固醇的積累。用真菌提取物處理馬鈴薯塊莖則積累倍半萜植物抗毒素[62]。在丙酮酸/磷酸甘油醛途徑中環化酶是該途徑中非常重要的酶，它采用親電聚合反應機制催化分子內部的環化，其反應過程非常復雜。單萜合成酶[63]和倍半萜合成酶[64]是目前研究較為透徹的環化酶。棉花被大麗菊輪枝霉誘導子處理可顯著增強法呢基二磷酸合成酶(FPs)的表達，同時使得半萜醛在細胞中的積累增加[65]。煙草倍半萜環化酶的啟動子基因是EAS4，將其與報告基因相連，在真菌誘導下，報告基因高水平表達。但是在水楊酸與茉莉酸甲酯作用下，則沒有表達，在H2O2：作用下只有低水平的表達[66]。對煙草細胞倍半萜烯的代謝環節茉莉酸甲酯和真菌誘導子產生不同的影響。真菌誘導的反應劇烈而快速，但產生合成倍半萜烯類植物抗毒素的關鍵酶的過程短暫[67]。要被細胞識別誘導子作為外界信號，首先是通過誘導子與細胞膜上受體的結合來實現的，這一過程會引起細胞膜透性的改變、離子平衡和運輸流向的變化。誘導子處理后能刺激細胞將次生產物向培養液中排放[68]。西洋參細胞培養物總皂甙的85%外排在培養液中在加入刺盤孢菌絲體誘導子；在人參細胞培養中加入刺盤孢菌和黑曲霉誘導子后，培養液中皂甙含量發生明顯變化，在培養液中可檢測到占細胞總量80%的皂甙成分[69]。利用這-特性，采用兩相培養等方法，可以不斷回收次生產物，改變代謝平衡，從而有利于產物的生物合成。另外，增加植物細胞對碳源的利用率可通過加入誘導子。劉長軍等[69]加入刺盤孢菌和黑曲霉誘導子后在人參細胞培養中，使蔗糖利用率從37%提高到59%。1.3.4影響誘導子作用效果的影響因素誘導子的作用效果與誘導子種類、誘導子濃度、誘導子加入時間以及誘導的時間長短等多種因素密切相關。不同種類的誘導子在植物細胞次生代謝調節中，因所具有的能被細胞受體所接受的信息類型、數量、時間先后不同，使誘導反應發生的類型、速度和強度不同，從而不同真菌誘導子表現出的生理活性有明顯差異[68]。植物細胞能識別某些專-結構的誘導物，并快速誘導活化特定的基因[40]。大量研究表明，同一誘導子對具有同一代謝途徑或具有相同前體的不同次生代謝物均有作用。蘭文智等[70]研究了50mg/L真菌誘導子(F5)，50mg/L水楊酸(SA)，50mg/LF5+50mg/LSA3種處理對紅豆杉懸浮細胞紫杉醇合成的影響，結果表明：3種處理方法均可提高紅豆杉細胞紫杉醇產量，特別以F5+SA處理得到產量最高，達到對照組的7.5倍。劉長軍等[58]在新疆紫草懸浮培養細胞中加入刺盤孢菌、尖孢鐮刀菌、黑曲霉、米曲霉四種真菌的粗提物，其中黑曲霉誘導子的效果最好，使苯丙氨酸解氨酶的活性顯著提高，并且紫草素的產率比對照提高30%多。誘導子的濃度對植物次生代謝物有非常重要的影響，其濃度與產物積累的關系可概括為兩種類型：一類為飽和曲線型，對產物合成不會產生負作用加入過量濃度的誘導子；另一類型為最適曲線型，誘導子劑量與細胞反應及產物合成曲線有一最適點，有些成分復雜的誘導子甚至會出現兩個最適濃度[71]。劉峻等[72]加入黑曲霉誘導子在20mg/L濃度在人參毛狀根中，使總苷含量增加到3.649%，而隨著黑曲霉誘導子濃度的增加，總苷含量有所下降，甚至低于對照；許建峰等[40]在高山紅景天懸浮細胞中加入不同濃度的黑曲霉誘導物，發現紅景天甙含量與真菌誘導濃度之間呈現飽和關系。不同誘導子及不同目標產物，誘導處理的時間是不同的。在長春花愈傷組織培養液中加入鐮刀菌(Fusariumsolani)和黑曲霉(Aspergillumniger)的真菌誘導子，結果表明，Fus誘導子和Asp誘導子對吲哚總堿及其中阿瑪堿、長春質堿的積累均有不同程度的正向調節作用，并且不同的真菌誘導子對不同的吲哚生物堿的最佳處理時間不同。FuS誘導子對長春質堿的誘導效果最好，最佳處理時間為16h，可使其含量比對照增加近3倍[73]。真菌誘導子處理長春花懸浮培養細胞，可以使長春花堿的產量提高2~5倍。其中細胞繼代培養7d后用誘導子處理3d是最好的加入時間[74]。1.3.5真菌誘導子在植物次生代謝物產生上的應用人們大量利用真菌誘導子提高次生代謝物產量在上世紀九十年代。加入曲霉粗提物在滇紫草細胞培養指數生長初期，可使紫草色素產量提高32%[52]。劉長軍等[68]在西洋參懸浮培養細胞指數生長末期加入刺盤孢菌絲體誘導子，總皂甙產率可由對照的296mg/L增加到679mg/L(約占細胞干重的(16.30%)，比對照提高約1.3倍，而且總皂甙的85%排放在培養液中。在紅豆杉細胞懸浮培養物中紫杉醇幾乎檢測不到，而加上橘青霉菌絲體提取物，可以使指數生長期的細胞的紫杉醇含量顯著提高，對細胞次生代謝產物產量有好的增加效果在培養細胞的指數生長末期或靜止期加入誘導子[49]。近年來，人們充分利用真菌誘導子的特點，不停研究次生代謝物合成的途徑及提高次生代謝物含量的方法，以尋找新的活性成分。目前真菌誘導子已被廣泛的應用于次生代謝物的生產在植物組織和細胞培養中。王紅等[75]利用3種真菌誘導子(大麗花輪枝孢、葡枝根霉和束狀刺盤孢)處理青篙的發根，結果均能促進發根中青篙素的積累，其中以大麗花輪枝孢的誘導效果最好，對細胞生長均沒有明顯影響。經大麗花輪枝孢處理的發根中青篙素含量達1.12mg/gDW，比對照(0.77mg/gDW)提高45%。楊世海等[76]加入黑曲霉誘導子在甘草愈傷組織的培養基中，發現加入真菌誘導子的最適濃度為2ml在50ml培養基中，此時誘導子促進黃酮類化合物形成的作用最大，甘草培養物中黃酮類化合物的含量為149.58μg/g，比對照(85.26μg/g)增加75%，低于或高于此濃度均不能最大程度地促進黃酮類化合物的生物合成。加入尖孢鐮刀菌的細胞壁粗提物在丹參毛狀根培養中，對總丹參酮積累的誘導效果很好，質量分數接近甚至超過了生藥水平(0.153mg/g)[77]。可使一些植物產生新的成分通過真菌的誘導作用。真菌誘導子可使得藥用植物Piqueriatrinervia培養細胞分泌的單萜類化合物piquerolA消失而分泌新單萜類化合物，這些新分泌的化合物有抗真菌的作用[78]。墨西哥柏樹中的大葉崖柏素是有抗菌活性的一種新的托酚酮，真菌誘導的懸浮培養細胞中的大葉崖柏素比對照含量高4倍[74]。真菌的誘導作用也有積極的意義對于解決生長困難的藥用植物藥源的問題。用肉蓯蓉中分離出的真菌菌絲體制成的誘導子能夠顯著提高肉蓯蓉的愈傷組織中的氨基酸含量，與野生植株相比，7種人體必需氨基酸均高于原植株[78]。1.4本研究目的與意義由于白藜蘆醇重要的保健作用和藥用價值，使其相關產品具有廣闊的市場空間和應用前景，對白藜蘆醇及相關產品的研制與開發具有重要意義。另外，由于釀酒葡萄正常條件下漿果內的白藜蘆醇含量很少，而受到病蟲害和外源刺激時可以提高釀酒葡萄中的白藜蘆醇含量，因此篩選出合適的誘導子對釀造優質的葡萄酒具有重要意義。本研究用真菌和水楊酸為誘導子，用赤霞珠葡萄組培苗作為誘導對象，為利用植物組織培養技術大規模合成白藜蘆醇這類葡萄細胞中主要的生物活性物質提供有價值的參數資料，為深入研究抗氧化酶與生物活性物質間相互關系提供重要的實驗資料；同時也為誘導子在藥用或其他功能性植物次生代謝產物上的應用提供實驗依據。第二章材料與方法2.1試驗材料與方法2.1.1試驗地點試驗與2015年5月至2016年1月在寧夏銀川市永寧縣葡萄種植基地和寧夏大學農學院葡萄與葡萄酒工程中心實驗室進行。試驗地處賀蘭山東麓玉泉營地區（Lt38°14′25″N，Ln106°01′43″E），屬于典型的大陸性氣候區，中溫帶干旱氣候，是中國葡萄栽培的最適生態區之一。這個地區晝夜溫差較大，干旱少雨，海拔1130-1200m，年平均溫度8.8℃，4-10月有效積溫1483.1~1534.9℃，年平均降水量180~200mm，年平均蒸發量1787.3mm，無霜期160~170d，全年太陽輻射總量598.71KJ/cm2，年平均日照時數達3200h左右，光能資源豐富，熱量適中，成土母質以沖積物為主，土壤為風沙土，土層深40-100cm，pH＜8.5，有機質含量0.4~1.0%。引黃河水灌溉。2.1.2試驗材料供試品種為寧夏大學葡萄與葡萄酒工程中心永寧縣玉泉營葡萄種植實驗基地的釀酒葡萄赤霞珠（CabernetSauvignon）2002年定植，東西行栽植，株距0.5m，行距3.0m，單臂籬架，肥力中等，中短稍修剪的苷通管理方式。赤霞珠（CabernetSauvignon）系屬法國波爾多古老品種，香氣濃郁，是傳統的釀造紅葡萄酒的優良品種。2.1.3試驗材料的采集與培養（一）外植體消毒及初代培養在晴朗的上午選取生長旺盛的赤霞珠葡萄新梢，分別剪取幼嫩的梢端、木質化和半木質化的莖段為外植體，帶回實驗室用紗布包裹于水龍頭下沖水一夜，剪為單芽莖段放在盛有蒸餾水的燒杯中，放入4℃冰箱1h（利于芽的萌發）。在超凈臺內進行表面消毒。消毒過程為：75%酒精消毒60s、無菌水沖洗1～2次、0.1%升汞溶液消毒6min、8min、10min、15min，或者5%次氯酸鈉消毒5min，再用無菌水沖洗4～5遍，剪去兩端接觸藥液的部分，最后用無菌的濾紙吸去莖段表面的多余水分，分別接種在MS培養基上，于光照條件(光強為30～40μmol?m-2?s-1，光照時間為14h?d-1)下培養，組培室溫度為(25±2)℃。培養基中均加入蔗糖30g?L-1、瓊脂7g?L-1，pH5.8。14d后統計莖段生長狀況和萌芽率。（二）繼代培養外植體接種25～28d后，單芽萌發生長至長度為5～6cm時，繼代培養。剪切萌發的新梢，去除大葉片后剪成單芽莖段(長10～15mm)，每瓶接種3個莖段。選用以下5種處理作為增殖培養基：F1：1/2MS+IBA0.2mg?L-1+KT1.0mg?L-1+蔗糖30g?L-1；F2：MS+6-BA0.5mg?L-1+IBA0.2mg?L-1+蔗糖30g?L-1；F3：1/2MS+IBA0.2mg?L-1+6-BA0.5mg?L-1+蔗糖30g?L-1；F4：1/2MS+IBA0.2mg?L-1+6-BA0.5mg?L-1+蔗糖20g?L-1；F5：1/2MS+IBA0.2mg?L-1+蔗糖20g?L-1。5種培養基均加入瓊脂7g?L-1(pH5.8)。篩選適宜的葡萄增殖培養基。繼代培養時，剪切萌發的新梢，留有葉片，將帶葉片的莖段（長10～15mm)接入F5（1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L）培養基中進行增殖培養，每瓶接種2個莖段；剪切萌發的新梢，去除葉片，并且將不帶葉片的單芽莖段（長10～15mm)也接入F5（1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L）培養基中進行增殖培養，每瓶接種2個莖段；30d后觀察統計組培苗生長發育情況。（三）生根培養選用繼代培養過程中生長健壯的組培苗，剪切長度在1.5～2.5cm并含有頂端生長點的新梢，接種在新的培養基(表3-1)中，培養基中均加入蔗糖20g?L-1+瓊脂7g?L-1(pH5.8)，進行壯苗和生根培養。2.1.4灰葡萄孢誘導子的制備灰色葡萄孢(Botrytiscinerea)系寧夏大學農學院顧佩雯老師饋贈。將灰色葡萄孢（Botrytiscinerea）在PDA平板培養基上培養7d后，用直徑為5mm的接菌針刮取菌餅，并將菌餅接種到預先分裝、滅菌的PDA液體培養基（每瓶250ml）中，每瓶接種2個菌餅，110-120r/min搖床振蕩培養5d，待菌絲體充分生長后收獲。將發酵液經真空過濾掉菌絲體，剩余菌液121℃滅菌20min后即為真菌誘導子粗體物。2.2試驗設計2.2.1灰葡萄孢誘導子對組培苗中白藜蘆醇含量及酶活性的影響選取同一生長時期，生長狀況一致的赤霞珠組培苗，向其培養基中加入不同濃度的灰葡萄孢誘導子，使培養基中誘導子的濃度為20mL/L、40mL/L、60mL/L，處理9d后取樣，用于白藜蘆醇含量的測定。加入與誘導子同體積的無菌水作為對照在同批次培養的組培苗中，每個處理重復三次。選取同一生長時期，生長狀況一致的赤霞珠組培苗，向其培養基中加入40mL/L的灰葡萄孢誘導子，在誘導培養的第3d、6d、9d、12d、15d取樣，用于白藜蘆醇含量的測定。加入與誘導子同體積的無菌水作為對照在同批次培養的組培苗中，每個處理重復三次。選取同一生長時期，生長狀況-致的赤霞珠組培苗，向其培養基中加入40mL/L的灰葡萄孢誘導子，在誘導培養的第3d、6d、9d、12d、15d取樣，用于SOD、POD、CAT、PPO、PAL的測定。加入與誘導子同體積的無菌水作為對照在同批次培養的組培苗中，每個處理重復三次。2.2.2水楊酸對組培苗中白藜蘆醇含量及酶活性的影響水楊酸（Salicylicacid，SA），分析純，500g。選取同一生長時期，生長狀況一致的赤霞珠組培苗，向其培養基中加入不同濃度的水楊酸，使培養基中水楊酸的濃度為50μM/L、100μM/L、150μM/L，處理9d后取樣，用于白藜蘆醇含量的測定。加入與誘導子同體積的無菌水作為對照在同批次培養的組培苗中，每個處理重復三次。選取同一生長時期，生長狀況-致的赤霞珠組培苗，向其培養基中加入100μM/L的水楊酸，在誘導培養的第3d、6d、9d、12d、15d取樣，用于白藜蘆醇含量的測定。加入與誘導子同體積的無菌水作為對照在同批次培養的組培苗中，每個處理重復三次。選取同一生長時期，生長狀況-致的赤霞珠組培苗，向其培養基中加入40mL/L的灰葡萄孢誘導子，在誘導培養的第3d、6d、9d、12d、15d取樣，用于SOD、POD、CAT、PPO、PAL的測定。加入與誘導子同體積的無菌水作為對照在同批次培養的組培苗中，每個處理重復三次。2.4測定項目及方法2.4.1真菌誘導子多糖含量測定用蒽酮比色法[79]測定制備的誘導子中的多糖含量，精確量取1.0ml菌液，加純水至2.0ml，混勻，加5ml蒽酮硫酸試劑，室溫顯色10min后比色，將吸光值帶入標曲，計算出多糖含量，為520.90μg/mL。根據誘導子中多糖的含量確定誘導子的添加量。誘導子粗體物于無菌條件下加入培養基中。2.4.2赤霞珠組培苗中白藜蘆醇含量的測定（一）白藜蘆醇的提取與白藜蘆醇標準品的制備取各處理及對照材料各0.8g，于95℃水浴30s，瀝干水進行研磨，加入6mL甲醇，然后4℃8000r/min離心10min，吸取上清液，經旋轉蒸發儀（40℃）濃縮蒸干后，用甲醇定容到2.0mL，過0.45μm濾膜作為供試樣品，存于4℃冰箱中待用。精密稱取白藜蘆醇對照品（購于上海源葉生物公司，純度＞99%）5mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋，制成含白藜蘆醇0.01g/L的標準品溶液，備用。（二）色譜條件色譜系統為AgilentTechnologies1100serie，柱溫30℃，流動相為乙腈-水（40：60），流速1.0mL/min，進樣量10μL，，檢測波長306nm，采用外標法進行定量測定。（三）線性關系的確定依次吸取不同體積的標準溶液進樣，出峰時間5.8min左右（如圖1），以Y表示峰面積積分值，以X表示標準品進樣量，，繪制標準曲線，其線性回歸方程為：Y=86.033X-15.164，相關系數r=0.9995。樣品溶液按與標準曲線相同的色譜條件進樣，根據峰面積計算樣品溶液中白藜蘆醇的含量。圖3-1白藜蘆醇標品出峰時間Fig.3-1Peakrettimeofresveratrol2.4.3酶活性的測定超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照熊慶娥介紹的方法[80]。酶液提取：在預冷的研缽中放入葉片0.5g，加3mL0.05mol/L，pH7.8磷酸緩沖液冰浴研磨成勻漿，倒入準備好的離心管中，再用4mL磷酸緩沖液分別沖洗研缽，并合并提取液，低溫（0-4℃，10000r/min）離心20min，上清液即為酶粗提取液。酶活測定：取4支試管，編號，按比例加入各溶液(含0.05mol/L磷酸緩沖液、130mmol/LMet溶液、750μmol/LNBT溶液、100μmol/LEDTA-Na2、20μmol/L核黃素溶液、蒸餾水、酶液或緩沖液)，混勻后將1支對照管置暗處，其他各管均置于4000Lx日光下反應20min。反應結束后，以不照光的對照管作空白，在波長560nm分別測定各管的吸光度(A)。超氧物岐化酶活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。過氧化物酶（POD）活性測定用愈創木酚法測定[81]。酶液提取：取葉片0.5g放入預冷的研缽中，加3mL0.05mol/L，pH7.8磷酸緩沖液冰浴研磨成勻漿，倒入離心管中，再用4mL磷酸緩沖液分別沖洗研缽，并合并提取液，低溫（0-4℃，10000r/min）離心20min，上清液即為待測酶液。酶活測定：取比色皿2只，一只加入反應混合液（含100mmol/LpH6.0磷酸緩沖液，愈創木酚，30%過氧化氫）3mL，緩沖液1mL作為調零對照，另一只加入反應混合液3mL，酶液1mL，立即開啟秒表，于470nm下測OD值，每隔30s讀數一次，讀4min，以每分鐘A470變化0.01為1個過氧化物酶活力單位。過氧化氫酶（CAT）活性測定 用紫外吸收法[82]測定。酶液提取：取葉片0.5g放入預冷的研缽中，加3mL0.05mol/L，pH7.0磷酸緩沖液冰浴研磨成勻漿，倒入離心管中，再用4mL磷酸緩沖液分別沖洗研缽，并合并提取液，低溫（0-4℃，10000r/min）離心20min，上清液即為待測酶液。酶活測定：取試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，各管按比例加入個溶液（含pH7.8磷酸緩沖液，粗酶液，蒸餾水），25℃預熱后，逐管加入0.3mL0.1mol的過氧化氫，每加完1管立即計時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數1次，共測4min，以1min內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。多酚氧化酶（PPO）活性測定參照Roach[83]的方法測定。酶液提取：取葉片0.2g放入預冷的研缽中，用10mL0.1mol/L，pH6.0磷酸檸檬酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿，冷凍離心（0-4℃，8000r/min）10min，上清液即為待測酶液。酶活測定：取試管2支，按比例加入各溶液（磷酸檸檬酸緩沖液，10g/L鄰苯二酚，1g/L脯氨酸，酶液或蒸餾水），2min后30℃恒溫水浴保溫10min，取出后4min460nm比色測定，酶活力以每g增加0.01為一個酶活力單位（u）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參考張志良等法[84]，有改動。酶液提取：取葉片0.1g，加入少量石英砂，0.01gPVP，吸取1mL0.1mol/L硼酸緩沖液（pH8.8，含5mmol/L巰基乙醇），于研缽中磨成勻漿，10000r/min離心15min，上清液即為待測酶液。酶活測定：反應混合液總體積為4mL，含0.2mL酶液（對照管中加入0.2mL緩沖液）1mL0.02mol/L苯丙氨酸，2.8mL蒸餾水，30℃水浴，30min后用紫外可見分光光度計290nm處測定吸光度值，以每小時吸光度變化0.01所需酶量為一個酶活單位。2.5數據統計分析試驗數據采用SAS、DPS7.05版結合Excel2003進行統計分析。第三章結果與分析3.1赤霞珠葡萄組培苗最適培養條件的研究3.1.1不同取材部位對外植體成活率的影響選取赤霞珠葡萄的幼嫩的梢端、半木質化、木質化的莖段為外植體接種，由表4-1可知，不同取材部位對莖段成活率存在顯著差異，其中，以半木質化莖段接種成活率最高，為96.5%，且萌芽所需時間最短，為4-7天，與其他兩個部位存在顯著差異。幼嫩新梢的外植體接種后大部分褐化死亡，接種成活率次之，為18%，萌芽所需時間為14天，與其他兩個取材部位差異顯著。木質化的外植體接種后污染嚴重，接種成活率最低，為4%，且萌芽所需時間最長，為20天，與其他兩個取材部位存在顯著差異。綜合分析，最適取材部位為半木質化的莖段。3.1.2不同消毒方法對外植體成活率的影響由表4-2可知，不同消毒方法對莖段消毒效果存在顯著性差異。用0.1%升汞溶液消毒外植體8min，接種后外植體的污染率低，為3.8%，污染率降低了88.3%，褐化率也較低，為2.5%，與5%的次氯酸鈉溶液存在顯著性差異。以5%的次氯酸鈉溶液消毒外植體5min，接種后外植體的污染率高，為92.1%，褐化率也較高，褐化率為3.77%，較0.1%升汞溶液提高了1.27%，與0.1%升汞溶液存在顯著差異。綜合分析，消毒效果最好的是用0.1%升汞溶液消毒外植體8min。3.1.3不同滅菌時間對外植體成活率的影響由表4-3可知，不同消毒時間對外植體消毒效果存在顯著性差異。隨著消毒時間增加，莖段的萌芽率隨著處理時間的增加，呈先增加后降低的趨勢，污染率呈下降趨勢，褐化率呈上升趨勢。莖段污染率隨著消毒時間不同各處理見存在顯著性差異，在處理時間8min時污染率與6min存在顯著性差異，污染率降低了29.34%；褐化率與10min、15min存在顯著性差異，此時萌芽率最高，為34%。綜合三種因素，莖段的消毒時間以8min為宜。3.1.4不同培養基對組培苗繼代培養及生根培養的影響繼代培養時，剪切萌發的新梢，留有葉片，將帶葉片的莖段（長10～15mm)分別接在F1、F2、F3、F4、F5培養基上繼代培養，由表4-4可知，不同培養基對組培苗的生長情況存在顯著性差異。F5培養基與其他培養基組培苗生根率存在顯著性差異，F5培養基的組培苗生長健壯，培養20天后生根，生根快且多又長，有須根生成，生根率為99.67%。F1與F2培養基的組培苗生長狀況也存在顯著性差異，F1培養基的組培苗生長矮小且生根較慢，且F1培養基不定芽生長的較多，生根率較F5培養基降低了54.37%；F2培養基的植株生長矮小，生根較慢，生根率僅為13%。F3、F4培養基組培苗與其他培養基組培苗生根率存在顯著性差異，F3、F4培養基植株生長矮小，無根生長，全部生成愈傷組織。綜合分析，F5培養基最適合赤霞珠葡萄繼代培養，每50d剪切單芽莖段繼代培養一次。由表4-5可知，不同激素濃度均可誘導根的生長，不同激素濃度對對組培苗生根培養存在顯著性差異。添加IBA0.2mg/L的培養基與其他三個處理存在顯著性差異，且生根率最高，為99.67%，根長最長，為15.3cm。添加IBA0.1mg/L和0.3mg/L的培養基之間差異不顯著，生根率分別為76.33%、74%。添加IBA0.4mg/L的培養基與其他三個處理存在顯著性差異，生根率最低，為49%，較添加IBA0.2mg/L的培養基降低了50.67%。綜合分析，赤霞珠組培苗生根生長最好為添加IBA0.2mg/L的培養基。3.1.5帶葉接種對組培苗生長發育的影響試驗中發現帶葉繼代培養與不帶葉繼代培養存在顯著性差異（表4-6），帶葉繼代培養植株萌芽快，生根率高，為99.67%，植株平均根數多，成苗率達88.9%。而不帶葉繼代培養植株生根率低，植株平均根數少，成苗率為52.4%，較帶葉降低了36.5%。因此組培苗的帶葉接種對加快繁殖速度提高繁殖系數節約時間等具有重要意義。3.2灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量及酶活性的影響3.2.1不同濃度的灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量的影響由圖4-1可見不同濃度的灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇合成的影響，不同濃度的灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中的白藜蘆醇含量均有一定的促進作用，各處理的組培苗中白藜蘆醇含量均顯著高于對照。其中，40mL/L的灰葡萄孢誘導子效果最好，比對照高96.9%，20mL/L的灰葡萄孢誘導子次之，是對照的1.55倍，以60mL/L的灰葡萄孢誘導子誘導效果最低，為22.64μg/g。由此可見誘導子濃度對白藜蘆醇含量的有非常重要的影響。3.2.2加入灰葡萄孢誘導子后不同培養時間對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量的影響由圖4-2可見不同的誘導培養時間對組培苗中白藜蘆醇合成的影響不同，其促進作用也不同。而且不同的誘導培養時間處理與對照之間白藜蘆醇的合成存在顯著性差異。在誘導培養第3-9d時，處理和對照的白藜蘆醇含量均呈直線上升趨勢，在第9-15d，處理的白藜蘆醇的含量逐漸下降，而對照的白藜蘆醇含量呈先下降后上升的趨勢。其中，處理第9d的白藜蘆醇的含量最高，且顯著高于對照，為38.1μg/g，比對照高1.67倍，處理第15d的白藜蘆醇含量最低，為21.7μg/g，比對照高1.1倍。由此可見，加入灰葡萄孢誘導子后赤霞珠組培苗中白藜蘆醇含量高于不加誘導子的組培苗。3.2.3灰葡萄孢對赤霞珠葡萄組培苗中苯丙氨酸解氨酶活性的影響圖4-3為灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中PAL活性的影響。從圖可以看出，在3-6d時，處理的PAL活性呈緩慢增長的趨勢，在6-9d時，處理的PAL活性迅速增加，在第9d時達到最大值，比對照反應激烈且顯著高于對照，并且達到極顯著水平，為121.7007U/g，比對照高2.17倍；之后又迅速下降，在第15d時降到最低，為48.0462U/g；與白藜蘆醇合成的變化趨勢具有一致性。對照和處理的PAL活性變化趨勢基本一致，都是先上升后下降，在第6d達到峰值，為76.4154U/g，之后又緩慢下降，對照PAL活性整體滯后于處理。3.2.4灰葡萄孢對赤霞珠組培苗中超氧化物歧化酶活性的影響圖4-4為灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中SOD活性的影響。從圖中可以看出，處理和對照的變化趨勢不同，處理在3-6d時呈下降趨勢，在第6-9d時處理的酶活性迅速增長，在第9d時達到最大值且顯著高于對照，為268.7758U/g，比對照高87.70U/g，之后酶活性緩慢降低，在第15d時降到最低。對照在第3-6d時呈下降趨勢，在第6-9d時對照的酶活性也迅速增加，且在第9d時達到最高，在第9-12d時又迅速下降，之后又緩慢上升。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在6-9d時呈上升趨勢。3.2.5灰葡萄孢對赤霞珠葡萄組培苗中過氧化物酶活性的影響圖4-5為灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中POD活性的影響。從圖中可以看出，添加灰葡萄孢誘導子對POD活性有一定影響。從變化趨勢看，處理在第3-6d時呈下降趨勢，并且與對照變化趨勢基本重合，在第6-9d時，處理的POD活性迅速增長，并在第9d達到最大值且顯著高于對照的POD活性，為185.574U/g。在第9-12d時，處理的POD活性又快速下降，之后又增加。對照在第6-9d時也迅速增長，并在第9d達到最大值，為117.193U/g，比處理減少了68.381U/g。在第9-12d時，對照的POD活性迅速下降，之后又緩慢下降。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在第6-9d時呈上升趨勢。3.2.6灰葡萄孢對赤霞珠組培苗中過氧化氫酶活性的影響圖4-6為灰葡萄孢誘導子對赤霞珠組培苗中CAT活性的影響。從圖中可以看出，添加灰葡萄孢誘導子對CAT活性有一定影響。從變化趨勢看，處理在第3-6d時呈上升趨勢，并且與對照變化趨勢基本重合，在第6-9d時，處理的CAT活性迅速增長，并在第9d達到最大值且顯著高于對照的CAT活性，為256.9805U/g。在第9-12d時處理的CAT活性又迅速下降，之后又緩慢下降。對照在第6-9d時緩慢增長，并在第9d達到最大值，為140.452U/g，比處理減少了116.5285U/g。在第9-12d時對照的CAT活性迅速下降，之后又緩慢增長。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在第6-9d時呈上升趨勢。3.2.7灰葡萄孢對赤霞珠組培苗中多酚氧化酶活性的影響圖4-7為灰葡萄孢誘導子對赤霞珠組培苗中PPO活性的影響。從圖中可以看出，添加灰葡萄孢誘導子對PPO活性有一定影響。從變化趨勢看，處理在第3-6d時呈下降趨勢，而對照呈緩慢上升的趨勢，在第6-9d時，處理的PPO活性迅速增長，并在第9d達到最大值且顯著高于對照的PPO活性，為74.0084U/g。在第9-15d時處理的PPO活性又迅速下降。對照在第6-9d時也迅速增長，并在第9d達到最大值，為35.1016U/g，比處理減少了38.9068U/g。在第9-12d時對照的PPO活性迅速下降，之后又緩慢下降。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在第6-9d時呈上升趨勢。3.2.8灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中抗氧化酶及多酚氧化酶活性的影響不同培養時間灰葡萄孢對葡萄組培苗中抗氧化酶活性的影響差異顯著。由表4-7可以看出，隨培養時間的增加，SOD，CAT，PPO活性呈先降低后升高又降低的趨勢，POD活性則呈先升高后降低的趨勢。當培養時間在第6-9d時，SOD，CAT，POD，PPO活性均呈上升趨勢，且在第9d時均達到最大值，分別為對照的148.4%，182.9%，158.3%和210.8%。3.3水楊酸對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量及酶活性的影響3.3.1不同濃度的水楊酸對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量的影響圖4-8為不同濃度水楊酸對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇合成的影響。不同濃度的水楊酸對組培苗中白藜蘆醇的積累均有一定促進作用，50μM/L，100μM/L水楊酸處理的組培苗中白藜蘆醇含量均顯著高于對照。其中，100μM/L的水楊酸誘導效果最好，比對照高44.8%，50μM/L的水楊酸誘導子次之，是對照的1.09倍，以150μM/L的灰葡萄孢誘導子誘導效果最低，與對照無顯著性差異，為20.21μg/g。由此可見誘導子濃度對白藜蘆醇含量的有非常重要的影響。3.3.2加入水楊酸后不同培養時間對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量的影響圖4-9為加入水楊酸后不同誘導培養時間對赤霞珠組培苗中白藜蘆醇合成的影響。從圖中可以看出，不同的誘導培養時間對組培苗中白藜蘆醇合成的影響不同，其促進作用也不同。而且不同的誘導培養時間處理與對照之間白藜蘆醇的合成存在顯著性差異。在誘導培養第3-6d時，處理和對照的白藜蘆醇含量均呈緩慢上升趨勢，在第6-9d時處理的白藜蘆醇含量迅速增加，在第9-15d，處理的白藜蘆醇的含量逐漸下降，而對照的白藜蘆醇含量變化趨勢總體比較穩定。其中，處理第9d的白藜蘆醇的含量最高，且顯著高于對照，為34.7μg/g，比對照高1.5倍；處理第15d的白藜蘆醇含量最低，為19.6μg/g，比對照高1.01倍。由此可見，加入水楊酸后赤霞珠組培苗中白藜蘆醇含量高于不加水楊酸的組培苗。3.3.3水楊酸對赤霞珠組培苗中苯丙氨酸解氨酶活性的影響圖4-10為水楊酸對赤霞珠葡萄組培苗中PAL活性的影響。從圖可以看出，在3-9d時，處理的PAL活性呈緩慢增長的趨勢，在第9d時達到最大值，比對照反應激烈且顯著高于對照，并且達到極顯著水平，為76.8521U/g，比對照高1.37倍；之后又迅速下降，在第15d時降到最低，為40.9106U/g；與白藜蘆醇合成的變化趨勢具有一致性。對照的PAL活性在3-6d時迅速增長，并且在第6d時達到最大值，為76.4154U/g，之后緩慢下降，對照整體滯后于處理。3.3.4水楊酸對赤霞珠組培苗中超氧化物歧化酶活性的影響圖4-11為水楊酸對赤霞珠葡萄組培苗中SOD活性的影響。從圖中可以看出，處理和對照的變化基本一致，處理在3-6d時呈下降趨勢，在第6-9d時處理的酶活性迅速增長，在第9d時達到最大值且顯著高于對照，為224.2621U/g，比對照高43.189U/g，之后酶活性迅速降低，在第12-15d時又開始增長。對照在第3-6d時呈下降趨勢，在第6-9d時對照的酶活性也迅速增加，且在第9d時達到最高，在第9-12d時又迅速下降，之后又緩慢上升。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在6-9d時呈上升趨勢。3.3.5水楊酸對赤霞珠組培苗中過氧化物酶活性的影響圖4-12為水楊酸對赤霞珠葡萄組培苗中POD活性的影響。從圖中可以看出，添加水楊酸對POD活性有一定影響。從變化趨勢看，處理在第3-6d時呈快速上升趨勢，在第6-9d時，處理的POD活性緩慢增長，并在第9d達到峰值且顯著高于對照的POD活性，為132.6096U/g。在第9-12d時處理的POD活性又迅速下降，之后又有所回升。對照在第3-6d時呈下降趨勢，在第6-9d時迅速增長，并在第9d達到最大值，為117.193U/g，比處理減少了15.416U/g。在第9-12d時，對照的POD活性迅速下降，之后又緩慢下降。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在第6-9d時呈上升趨勢。3.3.6水楊酸對赤霞珠組培苗中過氧化氫酶活性的影響圖4-13為水楊酸對赤霞珠組培苗中CAT活性的影響。從圖中可以看出，添加水楊酸對CAT活性有一定影響。從變化趨勢看，處理在第3-6d時呈上升趨勢，與對照變化趨勢基本一致，但活性低于對照，在第6-9d時，處理的CAT活性迅速增長，并在第9d達到最大值，為145.6641U/g。在第9-12d時處理的CAT活性又迅速下降，之后又緩慢上升。對照在第6-9d時緩慢增長，并在第9d達到最大值，為140.452U/g，比處理減少了5.2121U/g，與處理沒有顯著性差異。在第9-12d時對照的CAT活性迅速下降，之后又緩慢增長。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在第6-9d時呈上升趨勢。3.3.7水楊酸對赤霞珠組培苗中多酚氧化酶活性的影響圖4-14為水楊酸對赤霞珠組培苗中PPO活性的影響。從圖中可以看出，添加水楊酸對PPO活性有一定影響。從變化趨勢看，處理在第3-6d時呈下降趨勢，而對照呈緩慢上升的趨勢，在第6-9d時，處理的PPO活性迅速增長，并在第9d達到最大值且顯著高于對照的PPO活性，為77.1048U/g。在第9-15d時處理的PPO活性又迅速下降。對照在第6-9d時也迅速增長，并在第9d達到最大值，為35.1016U/g，比處理減少了42.0033U/g。在第9-12d時對照的PPO活性迅速下降，之后又有所回升。整體來看，處理的酶活性高于對照，且處理在第6-9d時呈上升趨勢。3.3.8水楊酸對赤霞珠葡萄組培苗中抗氧化酶及多酚氧化酶活性的影響不同培養時間水楊酸對葡萄組培苗中抗氧化酶活性的影響差異顯著。由表4-8可以看出，隨培養時間的增加，SOD，PPO活性呈先降低后升高又降低的趨勢，POD，CAT活性則呈先升高后降低的趨勢。當培養時間在第6-9d時，SOD，CAT，POD，PPO活性均呈上升趨勢，且在第9d時均達到最大值，分別為對照的123.8%，103.7%，113.1%和219.6%。第四章討論4.1赤霞珠葡萄組培苗最適培養條件的研究葡萄組培過程包括外植體接種、繼代增殖培養、生根誘導和馴化移栽4個環節[85]，每個環節都非常重要，做好前期的培養工作對后面誘導試驗能否成功具有重要意義。本研究通過選用葡萄新梢不同部位(幼嫩的梢端、木質化和半木質化的莖段)為外植體，進行消毒接種，發現以葡萄新梢的半木質化莖段作為外植體材料，接種培養污染率低，外植體萌芽率高，是葡萄組培的理想外植體。表面消毒劑選用75%酒精搭配0.1%升汞溶液消毒8min效果最好。啟動培養和繼代增殖培養是葡萄組培苗快速繁殖的關鍵階段，本研究以MS為啟動培養基，外植體萌芽快，成活率高。本研究釀酒葡萄赤霞珠的繼代增殖和生根培養基為添加IBA0.2mg?L-1和蔗糖20g?L-1的1/2MS培養基，擴繁增殖和生根壯苗可以同時進行。組培苗的新梢生長健壯，根系發達，成活率高。添加6-BA0.5mg?L-1、KT1.0mg?L-1和IBA0.2mg?L-1的1/2MS培養基中，組培苗不定芽發生數量多，但生長弱，且不易誘導生根，可能與培養基中鹽離子濃度高與外源激素類物質配比不適宜有關[86-87]。KT與6-BA對組培苗的生長發育效果不理想，這與前人的研究結果不相符合[88-90]，可能與KT、6-BA濃度、激素類物質配比和品種基因型差異有關。本研究以釀酒品種赤霞珠半木質化莖段為外植體，接種成活率高。啟動培養以MS基本培養基中的莖段萌芽率高。添加IBA0.2mg?L-1和蔗糖20g?L-1的1/2MS培養基可以用于莖段增殖培養和生根壯苗，且以帶葉莖段接種萌芽率高。4.2灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量及酶活性的影響4.2.1灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇含量的影響真菌誘導子是來源于真菌的一種特定化學信號，能引起植物過敏反應，能引發植物快速防御性應答反應在真菌與植物的相互作用中，因而誘導植物特定基因的表達具有快速、高度專一和選擇性的特點，進而活化特定次生代謝途徑，且特定的目的次生代謝產物的積累[91-93]。已經證明，提高植物次生代謝產物的有效手段之一是真菌誘導子[94-96]。白藜蘆醇作為植物的抗逆性物質一植保素，是植物對微生物或其它異物感染或傷害作出反應的產物，具有較高的抗菌性。Fregoni[97]研究發現白藜蘆醇含量高的植物對灰霉病的抗性強.在受到灰色葡萄孢侵染后的葡萄，距離壞死果實較近且沒有受到侵染果實中的白藜蘆醇含量很高，它對灰色葡萄孢等有明顯的抑制作用.Sbaghi等[98]在對13種葡萄及其變種研究后，發現葡萄的抗菌性與其所含白藜蘆醇量密切相關，這一特征可以作為葡萄抗菌性的標記[99]。說明利用真菌誘導子感染含有白藜蘆醇的植物，可望有效提高植物體內白藜蘆醇的含量.本試驗利用灰葡萄孢誘導子有效地提高了赤霞珠葡萄組培苗中白藜蘆醇的含量。真菌誘導子誘導植物次生代謝物的合成主要受誘導子種類、濃度、加入時間以及誘導的時間長短等因素的影響。在植物細胞次生代謝調節中不同種類的真菌誘導子，使誘導反應發生的類型、速度和強度不同，是所具有的能被細胞受體所接受的信息類型、數量、時間先后不同的緣故，[68]。本試驗中的灰葡萄孢誘導子對白藜蘆醇的合成有一定的促進作用，而且誘導效果較好，這可能是赤霞珠葡萄組培苗細胞表面受體選擇性地識別并結合了灰葡萄孢誘導子，它與灰葡萄孢誘導子的結合能力較強。這與類似研究的同具有苯丙烷類合成途徑的其他次生代謝物的研究結果一致。真菌誘導子的濃度對植物次生代謝物有非常重要的作用。通常高濃度誘導子對細胞生長有非常大的損傷，導致細胞生長停滯。主要是因為來源于真菌的誘導子很多有非常強的毒性。隨著植保素的誘導合成，植物病原性真菌也誘導了一個過敏反應，就是病毒與宿主細胞相互作用部位細胞的壞死，從而使細胞生長率下降，影響次生代謝產物的產量。雖然降低誘導子濃度可以減少生長的停止狀態，但是在誘導子作用下形成次生代謝產物的過程中，低濃度的誘導子只能引起部分誘導，因此誘導的劑量不同，引起的效應也不同。本試驗研究結果表明，灰葡萄孢提取物濃度為40mL/L時誘導效果最好，高于或低于這個濃度都不行。Eilert等[71]指出，誘導子濃度與產物積累的關系有兩種類型，即飽和曲線型和最適曲線型，本試驗應該屬于最適曲線型。不同誘導子及不同目標產物，誘導培養的時間不同。本研究中誘導培養9d后，誘導效果最好，這與類似的真菌誘導子處理懸浮細胞的研究結果不一致。誘導子處理懸浮細胞的時間很短，而本試驗處理時間長，可能是懸浮細胞較組培苗反應敏感，且懸浮細胞的外排能力強，使次生代謝反應更快。4.2.2灰葡萄孢對苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響植物次生代謝物中的一個重要途徑是苯丙烷類代謝途徑。連接初生代謝和苯丙烷代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶是PAL，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，它對植物體內的許多次生抗病物質(植保素、木質素和酚類物質)的合成與積累有重要的調節作用，可以作為衡量植物抗病性的生化指標之一，因此PAL在植物抗病反應中起著重要作用，認為是一種植物防御酶[100]。白藜蘆醇是，植物在惡劣環境下或遭到病原體侵害時，它是一種可抵御霉菌感染的植物自身分泌的抗菌素。白藜蘆醇的合成是苯丙氨酸一丙二酸途徑，苯丙氨酸首先經PAL的影響脫氨形成反式肉桂酸，反式肉桂酸在經一系列反應生成白藜蘆醇合成的底物香豆酰輔酶A，再與兩分子的丙二酰輔酶A作用就能生成白藜蘆醇。可見，PAL是合成白藜蘆醇的關鍵酶之一。本試驗中，經灰葡萄孢誘導子處理后的PAL活性呈先急速上升后快速下降的趨勢，與白藜蘆醇合成的變化趨勢具有一致性，均遠高于相應的對照，這與許建峰等[40]的研究結果一致。說明灰葡萄孢誘導子可以刺激赤霞珠葡萄組培苗，當組培苗感受外界刺激后，調節內部代謝能力，誘導活化PAL的活性，促使反應向合成白藜蘆醇的方向進行，從而提高白藜蘆醇的含量。4.2.3灰葡萄孢對抗氧化酶活性的影響植物雖然沒有和高等動物一樣的免疫系統，但明顯存在非常獨特的防御系統。早在60年前植物病理學家就發現，受到病毒或其他病原物侵染某些植物或植物的某些品種會產生類似于動物的免疫性反應表現為過敏反應，導致其細胞的生理、生化發生一定變化[101]。植物細胞受到真菌誘導子刺激后所發生的很重要的一個防御反應是氧迸發。所謂的氧迸發就是細胞中反應性氧的快速、短時間大量釋放的現象。這些活性氧組分主要包括：H2O2、O2-、OH-。氧迸發所產生的大量的活性氧組分，如果得不到及時清除，就會啟動細胞自殺程序而發生細胞凋亡[102]。當植物處于逆境條件時，外界的破壞因素使植物的代謝系統，酶的催化反應，基因的表達三者的統一性受到破壞，另外這些因素引發植物體內產生的自由基破壞功能分子，導致亞細胞結構功能的受損、衰老，直至死亡。在逆境條件下植物對脅迫損傷的防御系統有酶促反應系統，包括抗氧化酶系統。許多研究表明，在生物體內，通過POD、CAT、SOD的相互協調配合，消除過剩的自由基，使體內自由基維持在一個正常的動態水平。本試驗研究了灰葡萄孢誘導子對赤霞珠葡萄組培苗POD、CAT、SOD活性的影響。本試驗中誘導組的POD、CAT、SOD在6-9d時都上升，此后都有不同程度的降低。推測前期活性氧有一個積累過程，在第6d時積累到一定量，使得POD、CAT、SOD的活性迅速增加，以清除組培苗中過多的活性氧，9d后過多的活性氧己基本被清除，使得酶活性有不同程度降低。可能是前期活性氧的大量積累，作為誘導信號使組培苗內部細胞發生一系列生理變化以適應外界環境，從而激發各種防御系統，促使細胞代謝由初生代謝轉向次生代謝，促進白藜蘆醇的積累，與組培苗在誘導培養第6d時白藜蘆醇的積累達到高峰具有一致性。6d后由于組培苗中內的白藜蘆醇達到了一定的量，抑制了白藜蘆醇的合成，甚至使反應逆向進行，因此組培苗中的酶活性降低，白藜蘆醇的積累下降。4.2.4灰葡萄孢對多酚氧化酶（PPO）活性的影響赤霞