實驗二蛋白質的等電點測定和沉淀反應第一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二

一、實驗目的1、了解蛋白質的兩性解離性質2、學習測定蛋白質等電點的一種方法3、加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識。4、了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義。5、了解蛋白質變性與沉淀的關系。

第二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二二、實驗原理蛋白質是兩性電解質。在蛋白質溶液中存在下列平衡：第三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二蛋白質分子的解離狀態和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的PH達到一定數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質的等電點。不同蛋白質各有特異的等電點。在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。第四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二本實驗通過觀察不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。第五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。第六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二蛋白質的沉淀反應可分為兩類。第七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二可逆的沉淀反應

此時蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質而不變性。如大多數蛋白質的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質。提純蛋白質時，常利用此類反應。第八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二不可逆沉淀反應

此時蛋白質分子內部結構發生重大改變，蛋白質常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質沉淀與凝固，蛋白質與重金屬離子或某些有機酸的反應都屬于此類。第九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。第十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二三、試劑器材1、實驗材料：

雞蛋清牛乳2、儀器設備：水浴鍋溫度計錐形瓶100mL容量瓶吸管試管及試管架

第十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二0.4%酪蛋白乙酸鈉溶液取0.4g酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細地研磨，將所得的蛋白質懸膠液移入200mL錐形瓶內，用少量40—50℃的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內。加入10mL1mol/L醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋轉錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶內的溶液全部移到100mL容量瓶內，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻。3、試劑第十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二1.00mol/L醋酸溶液100mL0.10mol/L醋酸溶液300mL0.01mol/L醋酸溶液50mL蛋白質溶液500mL5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清：水=1:9）第十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二pH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液；3%硝酸銀溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結晶粉末；0.1M鹽酸溶液；0.1M氫氧化鈉溶液；0.05M碳酸鈉溶液；0.1M醋酸溶液；甲基紅溶液第十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二四、實驗操作（一）酪蛋白等電點的測定（1）取同樣規格的試管4支，按下表順序分別精確地加入各試劑，然后混勻。試管號蒸餾水mL0.01M醋酸mL0.1M醋酸mL1.0M醋酸mL18.40.6-—28.7-0.3—38.0-1.0—47.4--1.6第十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二（2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁（有顆粒沉淀）的一管pH即為酪蛋白的等電點。第十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二（二）蛋白質沉淀實驗第十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二1．蛋白質的鹽析：無機鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質。鹽的濃度不同，析出的蛋白質也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質沉淀，當降低其鹽類濃度時，又能再溶解，故蛋白質的鹽析作用是可逆過程。第十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。第十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二2．重金屬離子沉淀蛋白質：重金屬離子與蛋白質結合成不溶于水的復合物。取1支試管，加入蛋白質溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1~2滴，振蕩試管，有沉淀產生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？

第二十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二3．有機酸沉淀蛋白質：取1支試管，加入蛋白質溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。第二十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二4．有機溶劑沉淀蛋白質：取1支試管，加入2ml蛋白質溶液，再加入2ml95%乙醇。混勻，觀察沉淀的生成。第二十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二5．乙醇引起的變性與沉淀：

取3支試管，編號。依下表順序加入試劑：

試劑

mL

管號

5%卵清蛋白0.1M氫氧化鈉0.1M鹽酸95%乙醇

pH4.7緩沖液

111121113111第二十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內加水8ml，然后在第2、3號管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1M醋酸溶液及0.05M碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1M鹽酸溶液數滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發生的全部現象。第二十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二五、實驗結果管號pH值混濁度解釋現象1234（一）蛋白質等電點測定第二十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二（二）蛋白質的鹽析第二十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二1．蛋白質的鹽析現象解釋蛋白質溶液中加硫酸銨溶液加水上清液中加硫酸銨粉末加水第二十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二2．重金屬離子沉淀蛋白質

現

象解

釋蛋白質溶液中加硝酸銀

沉淀中加水

第二十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二3．有機酸沉淀蛋白質

現

象解

釋蛋白質溶液中加三氯乙酸

沉淀中加水

第二十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二4．有機溶劑沉淀蛋白質現

象解

釋

第三十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二5．乙醇引起的變性與沉淀管號操作現象