專業(yè)技術(shù)行業(yè)資料專業(yè)技術(shù)行業(yè)資料..................范文范例學(xué)習(xí)參考指導(dǎo).......液相色譜柱使用、保養(yǎng)與反相HPLC柱子的清潔與再生是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確牢靠的試驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。一、液相色譜柱的安裝：1、液相色譜柱的構(gòu)造：a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。7/163／16(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密1／16(Φ1.57mm)的連接收連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量削減柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接收通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再2．5mm蝕性，故使用時要留意，柱及連接收內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避開腐蝕。b、柱填料：液相色譜柱的分別作用是在填料與流淌相之間進展的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。3—10μm另一類正相填料是硅膠外表鍵合—CN，-NH2反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其外表鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。C8、C4、C23—10μm2，色譜柱的安裝：a、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。c、按柱管上標(biāo)示的流淌相流向，將色譜柱的入口端通過連接收與進樣閥出口相連接(如條件允許，1.57mm0.1-0.3mm管。連接收的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接收時肯定要設(shè)法降低柱外死體積。連接收通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，再用扳手連續(xù)順時針擰1／4-1／21／4至不漏液為止。二、液相色譜柱的使用：要留意：柱性能可能由于所使用的樣品、流淌相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是依據(jù)色譜柱出廠報告中的條件進展(出廠測試所使用的條件是最正確條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。1、樣品的前處理：a、最好使用流淌相溶解樣品。b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不行逆吸附的雜質(zhì)。c0.45μm2、流淌相的配制：的特點：a、流淌相對樣品具有肯定的溶解力量，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保存在柱中)。b、流淌相具有肯定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反響(特別狀況除外)。c、流淌相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分別效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流淌相的黏度)。dUV配制。e、流淌相沸點不要太低，否則簡潔產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致試驗無法進展。f、在流淌相配制好后，肯定要進展脫氣。除去溶解在流淌相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流淌相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。3、流淌相流速的選擇：4.6mm1mlmin4.0mm0.8ml／min中選用最正確流速時，分析時間可能延長。可承受轉(zhuǎn)變流淌相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。留意：a．由于甲醇廉價，對于反相柱推舉使用甲醇體系(必需使用乙腈的場合除外)。30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流淌相，沒有提純的己烷不得使18c．含水流淌相最好在試驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流淌相不要過夜。最好參加疊氮化鈉，防止細菌生長。d0.45μme．使用HPLC4、柱性能測試：啟動液相色譜儀：a1ml／min。。使用出廠測試時使用的流淌相組成及測試樣品。記錄并計算測試結(jié)果。*參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。高效液相色譜儀中反相HPLC柱子的清潔和再生它們與固定相的疏水相互作用的大小來分別的，含有疏水的機制也能以同樣的保存方式分別。固定相上還有少數(shù)物質(zhì)，如混合相〔例如苯基－己基〕、末端封閉和非末端封閉種類和極性嵌入相無機－有機混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點和缺點。的外表。有時候這些添加物有可能會污染鍵合相外表。pKa4.5，離子化能在中性pHA去除C2C4使用者必需清楚他們所用的固定相外表特別性質(zhì)和可能的分析物－固定相外表的相互作用，這樣質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填外表并且轉(zhuǎn)變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填外表。HPLC污染的反相柱子必需清洗和再生才能恢復(fù)原來的操作條件。這局部的“柱子觀看“將爭論可行的方法使柱子回復(fù)原來的或差不多原來的狀態(tài)。由于鍵合硅膠柱子是最受歡送的，我重點表達這種柱子。最終，我將爭論別的反相柱子的清潔步驟。HPLC這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保存值。那些保存值較小的物質(zhì)如鹽類一般來說在空體積時就被吸附在柱子外表的物質(zhì)通常就會積存在柱頭。這些行為通常只有通過平行試驗才能覺察。有著中等保存值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動，或者基線漂移。質(zhì)作用形成肯定的分別機理。保存時間會波動，拖尾會消滅。假設(shè)足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。清洗硅膠鍵合柱子HPLC90～100％的溶劑B〔雙溶劑反相系統(tǒng)中較強的溶劑〕20污染物。〔2HPLC〕例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。假設(shè)你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)領(lǐng)先用無緩沖流淌相〔即把緩沖液換成水〕5～10要用來清洗柱子樂，假設(shè)污染物是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過一個或多個另外的有機溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁上能找到推舉的溶劑系統(tǒng)。—般來說，全部的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加，常常最終一個溶劑是格外疏水的〔如醋酸乙酯甚至是烴〕，可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。我們必需保證一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。清洗過程要完畢時，必需借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個格外好的作為中間步驟的溶劑，由于它能與正己烷或二氯甲烷互溶又檢測器的話，避開溶劑在紫外區(qū)域有吸取，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。100％甲醇100％乙晴75％乙晴－25％異丙醇100％異丙醇100％二氯甲烷100％正己烷復(fù)原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推舉使用異丙醇，然后用沒有緩沖的流淌相，最終回復(fù)起始流淌相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡送的去除污染的溶劑。假設(shè)使用者〔DMSO50500.5ml/min的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個格外耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作還有一個問題是清洗過程中是否可以把HPLC2μm，5μm你是否把柱子反方向，最好不要讓溶劑通過檢測器避開污染物和穿透縫隙的顆粒進入檢測池，否則有可能引起污染。清洗柱子頻率主要看有多少強保存物質(zhì)被打入色譜柱。由于反相柱有時候在區(qū)分率消逝或者鬼峰你越是頻繁清洗柱子，就清洗起來就越不費力。清洗硅膠鍵合反相柱的蛋白質(zhì)剩余如果是生物物質(zhì)如血漿或血清等積存在反相色譜柱上，操作者必需承受不同的清洗程序。大局部液、酸、離子對試劑等的混合物則能有效地溶解。一開頭，先開頭嘗試用百分比含量高的高強度溶劑〔溶可以再生被污染的反相柱子。BhadwajDay250mm×46mm100μL〔見表三〕。在使用這些溶劑之前，可以先詢問柱子的廠商確保這些溶劑能與柱子的填料相容。硅膠基質(zhì)的柱子通常來說都是相容的，但有機聚合物基質(zhì)的柱子可能會在某些溶劑組合中膨脹或收縮，這樣會影響其色譜行為。40～50HPLC對于反相柱子，不建議用外表活性劑如十二烷基磺酸鈉〔SDS〕和三硝基甲苯，由于這些化合物必定會結(jié)實吸附在硅膠鍵合相柱子上很難除去。用外表活性劑會影響裝填外表而轉(zhuǎn)變其性質(zhì)。然而有一個分別小組的爭論說明由某個小組做的污染后的柱子可以用500μL1％SDS1ml/min5％～95％1％〔v/v〕三氟乙酸的乙晴梯度洗脫，可以恢復(fù)多肽的分別。清洗反相柱的特別技巧可能發(fā)生。用鰲合劑如0.05M〔EDTA〕通過色譜柱時，含有很多金屬離子的EDTAEDTApH他們轉(zhuǎn)為非離子狀態(tài)，這樣他們就可以被水－有機溶劑混合物洗脫下來。例如，強堿性物質(zhì)能在pH3pKa1：101：20500.1％疊氮化鈉在緩沖液中，用緩沖液保存的柱子不能長期不用。色譜工作者常常會爭論到離子對色譜中離子對試劑對固定相的影響。明顯離子對試劑如辛烷－磺酸〔用于陽離子〕和四烷基銨溴〔用于陰離子〕在肯定濃度的有機修飾劑下能很強地吸附在硅膠鍵合柱子上。柱子因此被污染很難回復(fù)到起始狀態(tài)，因此人們都認為任何用于離子對的柱子都會被破壞而且用于不能再用于一般的反相色譜。BidlingmeyerpH件下〔pH1-3〕硬化硅膠或在高pH〔pH7-8〕溶解硅膠使一些柱子的性質(zhì)轉(zhuǎn)變。要去除離子對試劑中的磺酸，他建議首先用一樣的沒有離子對的緩沖液〔至少20體積〕沖洗然后用沒有緩沖液的流淌相(在清BidlingmeyerC1870SDSChromolith柱子〔默克公司，德國〕可認為跟別的硅膠柱一樣。聚合柱子的再生1.0M1.0M〔苯乙烯－二乙烯基苯〕〔PS－DVB〕小球和聚合單體如CIMRP－SDVB〔BIA，Ljublijana，前蘇聯(lián)〕和Swift子〔Isco，Lincoln，Nebraska，美國〕能耐寬的pH〔通常pH11～13pH0～14〕，但使用者用8～10％交聯(lián)度的聚合物通常有較好的機械性能在水溶液中收縮很少在有機溶劑中膨脹也不大。用一系列溶劑洗聚合柱子之前最好能詢問生產(chǎn)者或技術(shù)支撐部門。BIAPS－DVB0.1210100％流淌相B5100％流淌相A1020％3070％乙醇的步驟。至少要用氫氧化鈉洗一個小時。3M50％60℃才能把這些蛋白質(zhì)除去。C18260nmHPLCZirChromSeparations，Inc.〔Anoka，Minnesota，USA〕生產(chǎn)了一系列的氧化鋯基質(zhì)柱子。該產(chǎn)pH以涂上氧化鋯能夠耐受更苛刻的條件如高pH的試驗條件用于成功分析各種分析物。羧酸，氟化物和磷酸根離子都在氧化鋯柱子上有強吸附。