酶工程復習資料第一章緒論一、酶是具備生物催化功效生物大分子。按照分子中起催化作用主要組分不一樣，自然界中天然存在酶可分為蛋白類酶（P酶）和核酸類酶（R酶）兩大類。二、酶工程酶生產、改性與應用技術過程稱為酶工程。核酸類酶分類依照酶催化反應類型，能夠將R酶分為：剪切酶、剪接酶和多功效酶。四、酶活力測定1）酶活力：是指在一定條件下，酶所催化反應初速度。在外界條件相同情況下，反應速度越大，意味著酶活力越高。2）酶活力單位酶活力高低是以酶活力單位數來表示。1961年國際生物化學與分子生物學聯合會要求：在特定條件下（溫度可采取25℃，pH等條件均采取最適條件），每1分鐘催化1μmol底物轉化為產物酶量定義為1個酶活力單位（IU）。另一個國際慣用酶活力單位是卡特（kat）。即在特定條件下，每秒催化1摩爾底物轉化為產物酶量定義為1卡特。1kat=6×10^7IU3）酶轉換數與催化周期酶轉換數（Kcat）：又稱摩爾催化活性，是指每個酶分子每分鐘催化底物轉化分子數。即每摩爾酶每分鐘催化底物轉化為產物摩爾數，是酶催化效率一個指標。轉換數倒數稱為酶催化周期。指酶進行一次催化所需時間。固定化酶活力測定1）與游離酶活力測定差異2）酶結合效率與酶活力回收率測定①酶結合效率：又稱酶固定化率，是指酶和載體結合百分率。②酶活力回收率：是指固定化酶總活力與用于固定化總酶活力百分率。六、酶生產1）酶生產：是指經過人工操作而取得所需酶技術過程。2）酶生產方法：提前分離法、生物合成法（最主要生產方法）、化學合成法。第二章微生物發酵一、酶發酵生產1）酶發酵生產：經過預先設計，經過人工操作，利用為生物生命活動取得所需酶技術過程。酶發酵生產是當今大多數酶生產主要方法。2）優良產酶微生物具備條件（特點）：①酶產量高；②產酶穩定性好；③輕易培養和管理；④利用酶分離純化；⑤安全可靠、無毒性。3）分類（依照微生物培養方式不一樣）：①固體培養發酵②液體深層發酵——現在酶生產主要方式③固定化微生物細胞發酵④固定化微生物原生質體發酵酶生物合成1）定義：指細胞內RNA和蛋白質合成過程。2）酶生物合成調整：組成型酶：在細胞中量比較恒定，環境原因對酶合成速率影響不大。適應型酶：在細胞中含量改變很大，其合成速率顯著受到環境原因影響。轉錄水平調整對酶生物合成是最主要調整。三、酶生物合成模型①同時合成型（A）：又稱生長偶聯型,是指酶合成與細胞生長同時進行，當細胞生長進入對數生長久時，酶也大量合成；當細胞進入穩定時時,酶合成也停頓。②延續合成型(B)：酶合成伴伴隨細胞生長而開始，但在細胞生長進入穩定時后,酶合成仍將延續較長一段時間。③中期合成型(C)：酶合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入穩定時后,酶合成也終止。④滯后合成型(D)：只有當細胞生長進入穩定時后才開始酶合成并大量積累(圖)。2）總結：①影響酶生物合成模式原因主要是mRNA和培養基中存在阻遏物。②在酶工業生產中，為了提升酶產率和縮短發酵周期，最理想酶合成模式是延續合成型；對于其它類型酶,要在菌種選育和工藝條件上加以調整；同時合成型：盡可能提升mRNA穩定性，如降低發酵溫度;滯后合成型：盡可能降低阻遏物；中期合成型：要從提升mRNA穩定性和解除阻遏兩方面進行。產酶微生物特點酶產量高；輕易培養和管理；產酶穩定性好；利于酶分離純化；安全可靠，無毒性。溶解氧調整方法調整通氣量；調整氧分壓；調整氣液接觸時間；調整氣液接觸面積；改變培養液性質。提升酶產量方法①添加誘導物（酶作用底物、酶催化反應產物、作用底物類似物）②降低阻遏物濃度③添加表面活性劑④添加產酶促進劑七、發酵動力學1）定義：是研究發酵過程中細胞生長速率、產物生成速率、基質消耗速率以及環境原因對這些速率影響規律學科。包含：細胞生長動力學、產物生成動力學和基質消耗動力學2）細胞生長動力學在連續發酵過程中，細胞生長動力學方程為：D為稀釋率，即單位時間內流加培養液與發酵液體積之比，單位為1/h。3）D與μm關系：（μ比生長速率）①μ>D時，dx/dt>0，發酵液中細胞濃度不停增加；②μ=D時，dx/dt=0，細胞濃度保持恒定；③μ<D時，dx/dt<0，細胞濃度不停降低；④但當D=μm時，細胞濃度趨于0，所以，必須控制適當D。⑤D=0時，為分批發酵4）將莫諾德方程改寫成倒數形式：（注意虛線）5）產物生成動力學（產酶動力學）產酶速率與細胞比生長速率、細胞濃度以及細胞產酶模式關于。X——細胞生長速率α——與生長偶聯產酶比系數（IU/g）β——非生長偶聯比產酶速率(IU/g?h)E——發酵液中酶濃度（IU/L）。判斷產酶類型：固定化微生物細胞發酵產酶1）固定化細胞：又稱為固定化活細胞或固定化增殖細胞，指采取各種方法固定在載體上，在一定空間范圍內進行生長、繁殖和新陳代謝細胞。2）固定化細胞產酶特點:（1）提升產酶率（2）可重復使用或連續使用較長時間（3）基因工程菌質粒穩定，不易丟失（4）發酵穩定性好（5）縮短發酵周期，提升設備利用率（6）產品輕易分離純化（7）適適用于胞外酶等胞外產物生產3）固定化細胞發酵工藝條件與前述游離細胞工藝條件基本相同。需要注意以下幾點：①固定化細胞預培養②溶解氧供給——關鍵限制性原因③溫度控制：適應范圍較寬④培養基組分控制：考慮特殊性原因第三章動植物細胞培養產酶一、動物細胞培養1）方式：懸浮培養、貼壁培養、微載體培養（固定化細胞培養）。①懸浮培養——血液、淋巴組織細胞、腫瘤和雜交瘤細胞②貼璧培養——淋巴組織以外組織、器官中細胞2）目標：取得疫苗、激素、多肽藥品、單克隆抗體、酶、皮膚等人體組織、器官等功效性蛋白質。植物細胞培養1）方式：固體培養、液體淺層培養、液體懸浮培養（次級代謝物生產過程中慣用）。2）目標：用于生產色素、藥品、香精、酶等次級代謝物。三、植物細胞培養特點：（與直接提取分離相比較而言）：①提升產率；②縮短周期；③易于管理、減輕勞動強度；④提升產品質量。四、植物細胞培養工藝流程：①外植體選擇與處理；②植物細胞獲取；③細胞懸浮培養；④分離純化，得到產物。五、植物細胞培養培養基與微生物培養基差異：①植物細胞生長和代謝需要大量無機鹽；②植物細胞需要多個維生素和植物生長激素；③植物細胞氮源為無機氮源；④植物細胞通常以蔗糖為碳源，濃度通常為2%—5%動物細胞培養特點（稍微了解）①生長遲緩②培養中需預防微生物污染③依照細胞起源選擇適當培養方式④培養基成份復雜，成本較高⑤原代細胞培養50代后會退化死亡⑥動物細胞沒有細胞壁，顯得十分脆弱，必須小心地控制溫度、pH值、滲透壓以及溶解氧等外界條件。工藝控制中幾點不一樣①培養基中必須添加氨基酸②溫度要求嚴格通常控制在36.5℃，允許波動為0.25℃③pH調整緩沖體系CO2與NaHCO3系統HEPES系統④滲透壓調整等滲狀態酶提取與分離純化酶提取與分離純化技術過程過程：細胞破碎、提取、離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結晶等。二、細胞破碎方法及其原理分類原理方法機械破碎經過機械運動產生剪切力，使組織、細胞破碎。搗碎法研磨法勻漿法物理破碎經過各種物理原因作用，使組織、細胞外層結構破壞，而使細胞破碎。溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學破碎經過各種化學試劑對細胞膜作用，而使細胞破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎經過細胞本身酶系或外加酶制劑催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達成細胞破碎自溶法外加酶制劑法提取1）酶提取是指在一定條件下，用適當溶劑和溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中過程，也稱為酶抽提。2）酶提取方法：提取方法使用溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大酶酸溶液提取PH2～6水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩定性很好酶堿溶液提取PH8～12水溶液 用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩定性很好酶有機溶劑提取可與水混溶有機溶劑用于提取那些與脂質結合牢靠或含有較多非極性基團酶3）影響提取主要原因①溫度：0~10℃②pH：4~6③提取液體積：提取液總量通常為原料體積3~5倍，最好分幾次提取。沉淀分離1）沉淀分離：是經過改變一些條件或添加一些物質，使酶溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其余溶質分離幾乎過程。2）沉淀分離是酶分離純化過程中經常采取方法。3）沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不一樣蛋白質在不一樣鹽濃度條件下溶解度不一樣特征，經過在酶液中添加一定濃度中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質分離等電點沉淀法利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不一樣兩性電解質有不一樣等電點這一特征，經過調整溶液pH值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質在有機溶劑中溶解度不一樣，經過添加一定量某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離復合沉淀法在酶液中加入一些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離選擇性變性沉淀法選擇一定條件使酶液中存在一些雜質變性沉淀，而不影響所需酶，從而使酶與雜質分離4）兩種鹽析方法：①Ks分段鹽析：在一定溫度和PH條件下（β為常數），經過改變離子強度使不一樣酶或蛋白質分離方法稱為Ks分段鹽析。②β分段鹽析：而在一定鹽和離子強度條件下（KsI為常數），經過改變溫度和PH，使不一樣酶和蛋白質分離方法稱為β分段鹽析。離心分離1）離心分離：是借助于離心機旋轉所產生離心力，使不一樣大小和不一樣密度物質分開技術。是最慣用一個方法。在離心分離時，要依照預分離物質以及雜質顆粒大小、密度及特征不一樣，選擇適宜離心機、離心方法和離心條件。2）離心條件確實定離心力與轉速換算：其中：n為離心機每分鐘轉數（r/min）；r為旋轉半徑（cm）；Fc為離心力；Fg為地心引力;RCF為相對離心力，即離心力F大小相當于地球引力（重力常數g）多少倍。過濾與膜分離1）過濾：借助于過濾解質將不一樣大小、不一樣形狀物質分離技術過程。包含膜過濾和非膜過濾。非膜過濾：采取高分子膜以外物質作為過濾介質（包含粗濾與微濾）。膜過濾：采取各種高分子膜為過濾介質（包含超濾與滲透）。2）膜分離技術①加壓膜分離；②電場膜分離；③擴散膜分離層析分離1）層析技術，亦稱色譜技術，是一個物理分離方法。它是利用混合物中各組分物理化學性質差異，使各組分以不一樣程度分布在兩個相中，其中一個相為固定(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不一樣速度移動，從而達成分離目標。2）層析分離方法層析方法分離原理吸附層析利用吸附劑表面對不一樣組分吸附性能差異分配層析利用各組分在兩相中分配系數不一樣離子交換層析利用不一樣組分對離子交換劑親和力不一樣凝膠層析利用一些凝膠對于不一樣分子大小組分阻滯作用不一樣親和層析利用生物分子與配基之間所具備專而又可逆親和力，使分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質等電點特征與離子交換層析特征結合在一起，實現組分分離電泳分離1）電泳（electrophoresis,EP）：指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質相反電極方向移動過程。2）分類：按支持體不一樣可分為：紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、自由電泳和等電聚焦電泳。3）顆粒在電場中移動速度主要決定于其本身所帶凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小影響，還受到電場強度、溶液PH、離子強度及支持體特征等外界條件影響。（電滲：在電場中，溶液對于固體支持物相對移動）顆粒在電場中移動速度影響原因：電場強度、溶液PH、溶液離子強度以及電滲。萃取分離1）萃取分離：利用溶質在互不相溶兩相之間分配系數不一樣而使溶質得到純化或濃縮方法。2）分類按兩相組成不一樣分為4類：有機溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取、反膠束萃取。3）雙水相萃取：兩相分別為互不相溶兩個水相。利用溶質在兩個互不相溶水相中溶解度不一樣而達成分離。雙水相體系：兩種不一樣水溶性聚合物濃度達成一定值時，體系會自然地分成互不相容兩相，組成雙水相體系。過程中關鍵是：制備好雙水相系統（選擇好適宜溶質、配置好溶液濃度和兩種溶液百分比）超臨界萃取1）超臨界萃取：又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質與雜質在超臨界流體中溶解度不一樣而達成分離一個萃取技術。2）超臨界流體(SCF)是指在臨界溫度和臨界壓力以上流體。高于臨界溫度和臨界壓力而靠近臨界點狀態稱為超臨界狀態。3）超臨界流體特點：①物理特征和傳質特征通常介于液體和氣體之間，適于作為萃取溶劑。②具備和液體一樣溶解能力。③密度比氣體大，與液體較為靠近，所以具備很高萃取速度。④伴隨溫度和壓力改變，其對物質萃取具備選擇性，萃取后易分離。⑤其黏度低于液體，靠近氣體，有利于氣體擴散。⑥不一樣物質有不一樣溶解度，易于分離。反膠束溶液（正）膠束反膠束形成表面活性劑溶于水，使其濃度超出臨界膠束濃度。表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超出臨界膠束濃度。結構表面活性劑極性基團在外，非極性基團在內，形成非極性關鍵。表面活性劑非極性基團在外，極性基團在內，形成極性關鍵，溶于水后，形成水池（waterpool）。功效 溶解非極性物質溶解極性物質反膠束溶液是透明、熱力學穩定系統。反膠束(reversedmicelle)是表面活性劑分散于連續有機相中一個自發形成納米級聚集體，所以表面活性劑是反膠束溶液形成關鍵。反膠束萃取是利用反膠束將酶或其余蛋白質從混合液中萃取出來一個分離純化技術。 結晶1）結晶（Crystallization）是指物質以晶體狀態從蒸汽或溶液中析出過程。結晶既是酶是否純凈標志（只有同類分子才能形成晶體），也是一個酶和雜蛋白分離方法。2）結晶條件：酶在結晶前，酶液必須經過純化達成一定純度，通常酶純度應在50％以上方能進行結晶。濃縮與干燥1）濃縮：從低濃度酶液中除去部分水或其余溶劑而成為高濃度酶液過程。2）干燥：是將固體、半固體或濃縮液中水分或其余溶劑除去一部分，以取得含水分較少固體物質過程。慣用干燥方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥。第五章酶分子修飾一、酶分子修飾1）定義：經過各種方法使酶分子結構發生一些改變，從而改變酶催化特征技術過程。2）修飾方法：⑴酶表面化學修飾①大分子修飾（大分子結合修飾）：是現在應用最廣酶分子修飾方法。1）修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價結合。2）應用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血類蛋白質（鏈激酶、尿激酶等）PEG－天門冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性；延長了酶在體內半衰期又如：用Dextran修飾-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶，提升了酶熱穩定性。②小分子修飾（酶蛋白側鏈基團修飾）1）定義：經過選擇性試劑或親和標識試劑與酶分子側鏈上特定功效基團發生化學反應。2）側鏈基團：組成蛋白質氨基酸殘基上功效團。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。3）側鏈基團修飾劑：采取各種小分子化合物。20種不一樣氨基酸側鏈基團中只有極性氨基酸側鏈易被修飾，它們通常具備親核性。③交聯修飾（交聯法）用雙功效基團試劑(如戊二醛)，與酶分子內不一樣肽鏈部分共價交聯，使酶分子空間構象愈加穩定。④固定化修飾（共價偶聯法）經過酶表面酸性或堿性殘基，將酶共價連接到惰性載體上，因為酶所處微環境發生改變，使酶最適pH、最適溫度和穩定性發生改變。⑵酶分子內部修飾①蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）在肽鏈限定位點進行水解，使酶空間結構發生一些精細改變，從而改變酶催化特征方法。（名解）②氨基酸置換修飾將肽鏈上某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引發酶蛋白空間構象改變，從而改變酶一些特征和功效方法。經過兩個路徑實現：化學修飾法：因為可用試劑限制，取得種類少。蛋白質工程：利用基因操縱技術。③金屬離子置換修飾改變酶分子中所含金屬離子，使酶特征和功效發生改變方法。為何要進行酶分子修飾？1)酶在細胞外穩定性差； 2)酶活性不夠高； 3)具備抗原性。酶化學修飾目標：①研究酶結構與功效關系。（50年代末）②人為改變天然酶一些性質，擴大酶應用范圍。（70年代末之后）1）提升酶生物活性（酶活力）。2）增強酶穩定性（熱穩定性、體內半衰期）。3）消除抗原性（針對特異性反應降低生物識別能力）。4）產生新催化能力。 第六章酶、細胞、源生質體固定化 一、為何固定化酶？①酶使用中有很多問題：②酶催化效率不夠高； ③酶穩定性差； ④酶一次性使用；⑤產物分離純化較難。二、幾個概念1）酶固定化：采取各種方法，將酶固定在水不溶性載體上，制備成固定化酶過程。2）固定化酶(immobilizedenzyme)：固定在載體上并在一定空間范圍內進行催化反應酶。3）固定化細胞通常只能用于胞外酶等胞外產物生產。三、酶固定化方法吸附法、結正當、交聯法、包埋法、熱處理法。四、固定化酶特征①酶穩定性：酶耐熱性、對變性劑、抑制劑、蛋白酶抵抗力增加。②酶最適溫度最適溫度與酶穩定性關于。多數酶固定化后熱穩定性上升，最適溫度也上升（有例外）。③酶最適pH帶負電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。影響固定化酶最適pH原因有兩個：載體帶電性質、酶催化反應產物性質。④底物特異性催化速度與底物分子質量大小關于。大分子底物催化速度降低，小分子底物影響較小或不受影響。五、固定化酶應用①氨基酰化酶——世界上第一個工業化生產固定化酶。②葡萄糖異構酶——世界上生產規模最大，應用最為成功一個固定化酶。③青霉素酰化酶——醫藥工業上廣泛應用一個固定化酶。④葡萄糖氧化酶——1967年Updike等采取酶固定化技術，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結合，組裝成了世界上第一個生物傳感器——葡萄糖氧化酶電極。細胞固定化1）細胞固定化：經過各種方法將細胞與水不溶性載體結合，制備固定化細胞過程。2）固定化細胞：固定在載體上并在一定空間范圍內進行生命活動細胞。3）固定化方法：1）吸附法；2）包埋法（與酶固定化方法不一樣）七、固定化動物細胞特點：①提升細胞存活率②提升產率③能夠重復使用或連續使用很長時間④易于與產物分開，利于產物分離純化固定化原生質體制備只要包含原生質體制備和原生質體固定化兩個階段。原生質體固定化通常采取網格包埋法（即凝膠包埋法）第七章酶非水相催化一、酶非水相催化1）定義：經過改變介質反應，影響酶表面結構和活性中心，從而改進酶催化特征。2）酶非水相催化主要內容：①有機介質中酶催化②氣相介質中酶催化③超臨界流體介質中酶催化④離子液介質中酶催化二、水對有機介質中酶催化影響1）必需水：維持酶分子完整空間構象所必需最低水量稱為必需水。2）最適水含量：在酶催化反應速度達成最大時水含量稱為最適水含量。3）水活度：是指體系中水逸度與純水逸度之比。通常可用體系中水蒸汽壓與相同條件下純水蒸汽壓之比表示。反應體系水活度在0.5~0.6之間。三、有機溶劑對有機介質中酶催化影響1）有機溶劑選擇：有機溶劑極性強弱用系數lgP表示。P是指溶劑在正辛烷與水兩相中分配系數。通常選取2≤lgP≤5溶劑作為催化反應介質。對映體選擇酶對映體選擇性又稱為立體選擇性或立體異構專一性，是酶在對稱外消旋化合物中識別一個異構體能力大小指標。立體選擇系數（KLD），立體選擇系數越大，表明酶對映體選擇性越強。五、pH特征1）pH印記或pH記憶：在有機介質反應中，酶所處pH環境與酶在凍干或吸附到載體上之前所使用緩沖液pH相同。有機介質中酶催化反應類型：非水相催化反應類型合成反應轉移反應醇解反應氨解反應異構反應氧化還原反應裂合反應水相催化反應類型氧化還原反應轉移反應裂合反應異構反應連接或合成反應水解反應第八章酶定向進化幾個概念1）定向進化：是指模擬自然進化過程，進行人工隨機突變，并在特定環境條件下進行選擇，使進化朝著人們所需方向發展技術過程。2）酶分子定向進化：簡稱酶定向進化，是模擬自然進化過程（隨機突變和自然選擇），在體外進行酶基因人工隨機突變，提議突變基因文庫，在人工控制條件下，定向選擇得到具備優良催化特征酶突變體技術過程。3）酶定向進化第一步是在體外人為地進行基因隨機突變，以取得豐富多樣突變基因。體外隨機突變技術有：易錯PCR技術、DNA重排技術、基因家族重排技術等。二、酶定向進化特點：①適應面廣；②目標性強；③效果顯著三、酶定向進化應用①提升酶催化效率；②增加酶穩定性；③改變酶底物特異性第九章酶反應器酶反應器1）酶反應器(Enzymereactor)以游離酶或固定化酶、固定化細胞作為生物催化劑，進行催化反應容器及其隸屬設備。2）酶反應器類型（了解最大特點及適用酶）反應器類型適用操作方式適用酶特點攪拌罐式反應器分批：BSTR連續：CSTR分批式,流加分批式連續式游離酶、固定化酶反應比較完全，反應條件輕易調整控制。填充床式反應器（PBR）連續式固定化酶密度大，能夠提升酶催化反應速度。在工業生產中普遍使用。流化床反應器（FBR）分批式流加分批式連續式固定化酶流化床反應器混合均勻，傳質和傳熱效果好，溫度和pH值調整控制比較輕易，不易堵塞，對粘度較大反應液也可進行催化反應。鼓泡式反應器（BCR）分批式流加分批式連續式游離酶固定化酶鼓泡式反應器結構簡單，操作輕易，剪切力小，混合效果好，傳質、傳熱效率高,適合于有氣體參加反應。在鼓泡時所耗壓降較大。膜反應