多聚酶鏈式反應擴增片段第一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五第二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五課程標準嘗試PCR技術的基本操作和應用。課標解讀1.理解PCR技術的基本原理。2.知道PCR技術的基本操作過程。3.討論PCR技術的應用。

第三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五1．生物體內DNA分子復制的條件

(1)四種

是合成子鏈的原料。

(2)

提供了DNA復制的模板。

(3)

打開了DNA雙鏈。

(4)

催化合成DNA子鏈。

(5)

使DNA聚合酶能夠從

開始連接脫氧核苷酸。PCR技術的原理及反應過程

脫氧核苷酸DNA母鏈解旋酶DNA聚合酶引物引物的3′端第四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五2．PCR擴增的原理及條件

(1)概念

PCR即

，是一種

迅速

的技術。它能以極少量的

為模板，在短時間內復制出上百萬份的

。

(2)原理 ①DNA的熱變性：在

的溫度范圍內，DNA雙螺旋結構解體，雙鏈分開，這個過程稱為

。當溫度緩慢

后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新

。 ②子鏈的合成：a.需要

；b.合成方向總是從子鏈的

端向

端延伸。多聚酶鏈式反應體外擴增DNA片段DNADNA拷貝80～100℃變性降低結合成雙鏈引物5′3′第五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五(3)條件①

模板。②分別與模板DNA兩條模板鏈相結合的兩種

。③A、T、G、C四種

。④耐熱DNA聚合酶，一般用

。⑤需要一定的

和能嚴格控制

的溫控設備。DNA引物脫氧核苷酸耐高溫的TaqDNA聚合酶緩沖溶液溫度第六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五3．PCR反應過程

PCR一般要經歷

次循環，每次循環可以分為

、

和

三步。

(1)

：當溫度上升到

以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。

(2)

：溫度下降到

左右，

通過

與兩條單鏈DNA結合。

(3)

：溫度上升到

左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在

的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA

鏈。三十多變性復性延伸變性90℃復性50℃兩種引物堿基互補配對延伸72℃DNA聚合酶第七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五[思維激活1]DNA復制緣何必須有引物？提示DNA聚合酶不能從頭合成DNA，而只能以3′延伸DNA鏈，故DNA合成時，必須加入引物(其3′游離)以作為延長DNA子鏈的“引子”。第八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五1．細胞內DNA復制和細胞外PCR擴增的比較(見下表)項目DNA復制PCR擴增不同點場所細胞內細胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐熱的TaqDNA聚合酶是否有轉錄伴有轉錄、產生引物無轉錄、需加入兩種引物特點邊解旋邊復制，半保留復制體外迅速擴增循環次數受生物體自身控制30多次緩沖液不需要需要人為控制設備無需要嚴格控制溫度變化的溫控設備第九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五相同點原料四種脫氧核苷酸復制原理嚴格遵循堿基互補配對原則模板DNA為模板引物都需要與模板相結合的引物第十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五2.PCR過程

(1)變性 當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。

(2)復性 溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。第十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五(3)延伸溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。第十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五特別提醒(1)72℃左右時，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5′端向3′端延伸。(2)DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使該段固定長度的序列呈“指數式”擴增。第十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五【鞏固1】

標準的PCR過程一般分為變性、復性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是 (

)。

A．94℃、55℃、72℃ B．72℃、55℃、94℃ C．55℃、94℃、72℃ D．80℃、55℃、72℃

解析當溫度上升到90℃(90～96℃)以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，稱之為變性；當溫度下降到50℃(40～60℃)左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；當溫度上升到72℃(70～75℃)時，溶液中的四種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。 答案A第十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五1．實驗用具

(1)PCR儀：該儀器能自動調控

，實現DNA的擴增。如果沒有PCR儀，可用3個

代替，操作時按程序在3個

中

PCR反應的微量離心管。

(2)微量離心管：總容積為

，實際上是進行

的場所。

(3)微量移液器：用于

。PCR技術的實驗操作及評價

溫度恒溫水浴鍋水浴鍋來回轉移0.5mL多聚酶鏈式反應轉移PCR配方中的液體第十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五2．操作步驟 準備→

→混合→

→反應。3．操作提示

(1)為避免

等因素的污染，實驗中使用的一些用具在使用前必須進行

。

(2)所用的

和

應分裝成小份，并在

儲存。

(3)在

中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須

。加入組分設置PCR的循環程序外源DNA高壓滅菌緩沖液酶－20℃微量離心管更換第十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五[思維激活2]PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋轉酶嗎？提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但該解旋過程不是DNA解旋酶催化的結果，而是利用DNA熱變性的原理，在80～100℃溫度范圍內，DNA雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，以此達到解旋的目的。第十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五1．PCR儀：PCR自動化程度較高，參照下表設計程序即可。循環數變性復性延伸第1次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min第十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五(將微量離心管放在離心機上，離心約10s。目的是使反應液集中在離心管底部)

第十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五第二十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五3．實驗中DNA含量的測定

DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關。可以利用DNA這一特點進行DNA含量的測定，具體方法如下： ①稀釋：2μLPCR反應液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋 ↓ ②對照調零：以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數調節至零 ↓第二十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五③測定：取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值↓④計算：DNA含量(μg)＝50×(260nm的讀數)×稀釋倍數特別提醒若沒有PCR儀，可進行水浴擴增DNA設置3個恒溫水浴鍋，溫度分別為94℃、55℃和72℃，在3個水浴鍋中依據PCR儀的處理時間來回轉移PCR反應的微量離心管即可。第二十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五【鞏固2】

聚合酶鏈式反應(PCR技術)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，其簡要過程如圖所示。下列關于PCR技術敘述不正確的是(

)。

A．PCR技術是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術

B．反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板

C．PCR技術中以核糖核苷酸為原料，以指數方式擴增

D．應用PCR技術與探針雜交技術可以檢測基因突變第二十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五解析PCR技術是人工合成DNA的方法，原料是脫氧核苷酸而不是核糖核苷酸。答案C第二十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五【例1】

(2011江蘇)請回答有關問題。

(1)利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。PCR技術的原理

第二十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五①從理論上推測，第四輪循環產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為________。②在第______輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。第二十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期五①第1組：________________；②第2組：________________。(3)PCR反應體系中含有熱穩定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為_________________。第二十七頁，共三十三頁，編